龚小见，苏 敏，赵 超，周 欣*

(1.贵州师范大学 贵州省山地环境信息系统与生态环境保护重点实验室，贵州 贵阳 550001；2.贵州师范大学 贵州省药物质量控制及评价技术工程实验室，贵州 贵阳 550001；3.贵州师范大学 天然药物质量控制研究中心，贵州 贵阳 550001)

近年来，各类食品安全事件频发，威胁人们健康和社会稳定。农产品生产过程中农药的使用会导致其残留在农作物体内，当农药富集到一定量后将会影响人体健康[1]。吡虫啉(Imidacloprid)是20世纪80年代由德国和日本农药公司共同开发的一种内吸、高效、残效期长的农用优良新烟碱类杀虫剂，化学名为1-(6-氯-3-吡啶基甲基)-N-硝基咪唑烷-2-亚胺，分子式为C9H10ClN5O2。其化学性质稳定，广泛用于种子、叶面和土壤中多种害虫的防治[2-3]。吡虫啉会使人产生嗜睡、心悸、呕吐、头晕和定向障碍，严重者导致心率过缓及心肺骤停[4]，并具有基因毒性和免疫毒性等严重的毒副作用[5-6]。因此，分析吡虫啉在动物体内的代谢过程和代谢动力学参数可为合理安全用药提供科学依据。

目前关于吡虫啉在果蔬以及土壤中的残留检测报道较多，分析方法主要包括高效液相色谱法[7-10]、高效液相色谱-质谱联用法[11-14]和气相色谱-质谱联用法[15]，但对吡虫啉在动物体内的代谢过程研究较少。本文对SD雄性大鼠灌胃68.1mg·kg-1吡虫啉(10% LD50值)[16]，采用甲醇直接沉淀蛋白质的方法处理血浆样品，建立了HPLC测定大鼠血浆中吡虫啉含量的方法。同时采用药代动力学软件(DAS2.0软件)对吡虫啉灌胃给药后大鼠的平均血药浓度～时间数据进行分析，初步掌握了吡虫啉在动物体内的变化规律。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

DIONEX Ultimate3000型高效液相色谱仪(包括四元泵处理器、自动进样器、RS柱温箱、二极管阵列检测器以及 Chromeleon7.2色谱工作站)，TGL-16M型离心机(长沙迈佳森仪器设备有限公司)，XS105DU型十万分之一电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)，EYELAMG-2200型氮气吹干仪(日本东京理化器械株式会社)。

吡虫啉标准品(纯度98%，贵州迪大科技有限责任公司)；肝素钠(贵州迪大科技有限责任公司)，以蒸馏水配制成1000IU/mL；甲醇(色谱纯，Tedia公司)；甲醇(分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司)；生理盐水(贵州科伦药业有限公司)；实验用水为自制蒸馏水。

雄性SD大鼠(长沙市天勤生物有限公司)，体重为150～250g，SPF级，许可证号:SCXK(湘)2015-0011。

1.2 仪器工作条件

色谱柱为Agilent ZORBAX C18柱(4.6mm×250mm，5μm )，流动相为甲醇-水(30∶70)，进样量20μL，检测波长245nm，流速1.0mL/min，柱温为室温。

1.3 实验方法

1.3.1对照品溶液的配制精密称取2.0 mg吡虫啉标准品，用适量甲醇溶解并定容至10 mL，配成0.2 g/L的储备液，使用时以甲醇稀释至所需质量浓度。

1.3.2供试品的制备取100 μL血浆样品置于1.5 mL离心管中，加入400 μL甲醇，涡旋1.0 min充分混匀，在4 ℃下以13 000 r/min离心10 min，取上清液于1.5 mL空白离心管中，以40 ℃氮气吹干，残留物加入100 μL甲醇，涡旋振荡混合30 s，4 ℃下以13 000 r/min离心10 min，取上清液20 μL进样。空白血浆按上述方法处理。

1.3.3吡虫啉的代谢动力学试验随机选取6只健康雄性SD大鼠，实验前12 h禁食不禁水，灌胃给药68.1 mg·kg-1吡虫啉，在给药前5 min和给药后0.5、1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5、10.5、12.0、15.0、18.0、20.0、24.0 h，经眼眶取血0.5 mL，用肝素钠抗凝的离心管采集血样，血样在4 ℃下以13 000 r/min离心10 min，分离血浆置于空白离心管中，于-80 ℃冰箱储存备用。

2 结果与讨论

2.1 蛋白沉淀剂的选择

分别考察了甲醇、乙醇、乙腈、丙酮作为蛋白沉淀剂的效果，发现丙酮作蛋白沉淀剂时对色谱峰有干扰，且操作繁琐；乙醇、乙腈为蛋白沉淀剂时的平均回收率低于甲醇，甲醇为蛋白沉淀剂的平均回收率为74.7%，因此选择甲醇作为蛋白沉淀剂。

2.2 流动相的选择

考察了甲醇-水和乙腈-水体系为流动相时的分离效果，结果表明，两种流动相均能将吡虫啉与基质干扰峰分开。考虑到成本及环保等因素，最终选择甲醇-水作为流动相，其最优体积比为30∶70。

图1 空白加标血浆(100 mg·L-1)的色谱图Fig.1 Chromatogram of the blank spiked(100 mg·L-1) plasma

2.3 方法专属性

取空白血浆，按照“1.3.2”方法处理，精密取20 μL进样，得空白血浆的HPLC图；取空白血浆，精密加入100 μL质量浓度为100 mg·L-1的吡虫啉对照品，采用上述方法处理，得加标血浆样品的HPLC图。由图可知，血浆中的内源性物质不干扰吡虫啉的测定，被测物的色谱峰形良好(图1)。

2.4 线性范围、检出限及定量下限

取SD大鼠空白血浆8份，每份100 μL，分别加入标准系列对照品溶液，涡旋1.0 min，按照“1.3.2”方法操作，配成吡虫啉质量浓度为0.5、2.5、10、20、40、80、100 mg·L-1的标准溶液，精密吸取20 μL进样分析。以吡虫啉的质量浓度(X，mg·L-1)为横坐标，对应峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归。吡虫啉在0.5～100 mg·L-1范围内呈良好的线性关系，回归方程为Y=0.322 6X-0.228 8(r2=0.999 8)。以目标化合物与其附近基线噪音的比值(S/N)确定检出限(S/N=3)及定量下限(S/N=10)，得血浆样品中吡虫啉的检出限为10 μg·L-1，定量下限在100 μg·L-1以内。

2.5 提取回收率

精密取SD大鼠空白血浆100 μL，配制吡虫啉质量浓度为10、15、20 mg·L-1，每个质量浓度样品各3份，按照“1.3.2”方法处理；同法配制吡虫啉质量浓度为10、15、20 mg·L-1的对照品溶液，每个质量浓度各3份，过0.45 μm滤膜后取20 μL进样。以空白加标血浆样品与标准溶液的色谱峰面积比值计算回收率，得吡虫啉的平均回收率为74.7%。

2.6 精密度

精密吸取空白血浆100 μL，加入不同质量浓度的吡虫啉对照品溶液100 μL，分别配制成10、15、20 mg·L-13个水平的质控样品，按照“1.3.2”方法处理，分别连续进样3次计算日内相对标准偏差(RSD)；连续测定3 d，计算日间RSD。结果表明，样品的日内RSD不大于5.4%，日间RSD不大于6.2%，符合生物样品分析方法指导原则的规定。

2.7 稳定性试验

配制100 μL质量浓度分别为10、15、20 mg·L-1的吡虫啉加样血浆各9份，3份在室温下放置24 h后按照“1.3.2”方法处理和分析，考察样品在室温下的稳定性；3份于-20 ℃冰冻，取出融解，反复冻融3次后同法处理和分析，考察样品的3次冻融稳定性；3份于-20 ℃冰冻半个月后取出自然解冻，同法处理和分析，考察样品的长期稳定性。所得结果的RSD为3.7%～9.6%，表明样品的稳定性较好。

图2 吡虫啉的血药浓度～时间曲线Fig.2 Concentration-time curve of imidacloprid in plasma

2.8 吡虫啉在大鼠体内的药代动力学研究

按照“1.3.3”方法取100 μL血浆样品，采用“1.3.2”方法处理后进行测定。所得结果采用药代动力学软件(DAS 2.0版软件)进行数据处理，绘制动力学曲线(图2)，药代动力学参数见表1。

表1 吡虫啉的药代动力学参数Table 1 The pharmacokinetic parameters of imidacloprid

结果表明，分布半衰期(t1/2α)小于消除半衰期(t1/2β)，说明吡虫啉在大鼠体内分布较快，主要以消除为主；达峰时间(tmax)为7.333 h，达峰血药浓度(Cmax)为23.557 mg/L，药时曲线下面积(AUC(0-t))为276.727 mg·h/L，表观分布容积(Vd)为842.796 L/kg，清除率(CL)为137.991 L/(h·kg-1)，这些数据说明吡虫啉在大鼠体内吸收慢，达峰时间长，血药浓度高，体内分布广，消除速率快；K21大于K12，表明吡虫啉从周边室向中央室转运的速率大于从中央室向周边室转运的速率，说明吡虫啉主要分布在血液和血流丰富组织中。综上所述，吡虫啉在大鼠体内呈二隔室模型分布，以一级药代动力学方式消除。

3 结 论

本文建立了测定大鼠血浆中吡虫啉含量的RP/HPLC方法，该方法前处理简单、回收率较高、稳定性好、操作简便，可用于生物样品中吡虫啉含量的测定。采用所建立的方法研究了SD大鼠灌胃给药量为68.1 mg·kg-1(10%LD50)吡虫啉的药代动力学行为，测定了不同时间下血浆中吡虫啉的浓度，并拟合计算了给药后大鼠体内的药代动力学参数，为吡虫啉的合理安全用药提供了科学依据。