彭开敏，叶 泰，曹 慧，袁 敏，于劲松，徐 斐

(上海理工大学 医疗器械与食品学院，上海食品微生物工程研究中心，上海 200093)

拟除虫菊酯类农药是人工合成的一类高效、广谱、神经致毒性仿生杀虫剂[1]，广泛应用于防治蔬菜、棉花、果树、花卉害虫[2]。但其残留会导致生物体中枢神经系统严重损害。因此，新型拟除虫菊酯类农药残留的快速检测方法研究受到了广泛关注[3]。目前，对于拟除虫菊酯类农药残留的快速检测通常基于酯键水解建立针对水解产物中氰基或间苯氧基苯甲醛及其衍生物的检测方法[4]。但严苛的水解条件(强碱性试剂)和水解产物的不确定性，在一定程度上限制了拟除虫菊酯类农药快速检测方法的应用[5-6]。

羧酸酯酶能够专一地水解拟除虫菊酯类农药[7-8]，且水解条件温和、操作简便[9]，在酶法农药快速检测领域显示出巨大的潜力和优越性[10]。但是，通过湿法固定的羧酸酯酶表观活性较低，水解产物得率偏低，限制了酶水解方法快速检测拟除虫菊酯农药的灵敏度[11]。而近年来出现的有机-无机杂化纳米材料可有效地解决该问题。Zare等[12]首先提出了一种基于金属离子的盐溶液合成含酶杂化“纳米花”的新方法，其生物催化实验[13]证实纳米花结构能够有效提高酶分子的体外催化活性和催化稳定性[14]。基于此，Ke等[15]将钙离子作为无机成分和脂肪酶制备脂肪酶纳米花，其活性比游离脂肪酶高308%，且制成的脂肪酶纳米花的储藏稳定性更高；Ye等[16]利用转氨酶和钙离子制备的转氨酶杂化纳米花装载了足够的转氨酶并增强了转氨酶的活性，所制备的纳米花也是一种兼具生物识别和信号放大功能的标记物，在病原微生物的检测方面有广阔的应用前景。Zhao等[17]利用α-乙酰乳酸脱羧酶和钙离子合成了α-乙酰乳酸脱羧酶纳米花，并用于消除啤酒异味、缩短啤酒熟化时间，在啤酒酿造行业具有很大的应用潜力。

本文制备了基于猪肝酯酶(PLE)的杂化“纳米花”，通过优化不同的制备参数获得最优制备条件，采用红外光谱、扫描电镜和元素能谱分析对猪肝酯酶杂化“纳米花”进行表征，并研究了该“纳米花”对4种菊酯农药的水解性能。基于Ca3(PO4)2-PLE杂化纳米花对拟除虫菊酯类农药的高效水解，制作酶水解型传感器，有望为进一步探究拟除虫菊酯类农药残留的快速检测方法提供新的途径和思路。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

猪肝酯酶(PLE，Novocata公司)；氰戊菊酯、甲氰菊酯等菊酯类农药(上海农药研究所)；氯化钙、海藻酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、乙腈、十二烷基硫酸钠(SDS)及其他试剂(上海国药化学试剂有限公司)；所有试剂均为分析纯，实验用水为双蒸水。

TU-1901型可见分光光度计(北京普析公司)；Waters1525高效液相色谱仪(美国沃特世公司)；Sepax HP-C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm，美国赛分公司)；Quanta F250式热场扫描电镜(美国FEI公司)；S4800式冷场扫描电镜(日本日立公司)；iS5傅立叶红外扫描仪(美国Nicolet公司)；ZDDN-Ⅱ自动型凯氏定氮仪(浙江托普公司)。

1.2 Ca3(PO4)2-PLE杂化纳米花的制备

通过共沉淀法合成“纳米花”[18]：首先在磷酸盐缓冲溶液(10mmol/L，pH7.4)中制备质量浓度为0.3g/L的PLE溶液，再将90μL CaCl2溶液(500mmol/L)加至6mL上述PLE溶液中，于20℃下孵育12h。离心(12000r/min，10min)收集沉淀，用水洗涤3次以除去非特异性吸附的蛋白，储藏于4℃冰箱中待用。

1.3 液酶与Ca3(PO4)2-PLE杂化纳米花活性的测定

液酶的酶活测定根据文献方法[19]改进：将液酶用2mL柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液(pH6.4)振荡悬浮后，用双蒸水稀释3000倍。在3mL稀释酶液中加入50μL底物(16mmolα-乙酸萘酯的丙酮溶液)混合均匀，在30℃下孵育5min，然后与0.5mL显色剂(0.4%固兰B的1.8%SDS溶液)混合均匀，再于30℃下保温5min。以不加底物(α-乙酸萘酯)的反应液作空白，测定595nm处的吸光度值。在上述条件下，每分钟猪肝酯酶催化该反应体系，使其在595nm处的吸光度值升高1所需的酶量定义为猪肝酯酶活力。根据下式计算液酶的活力[20]：

式中：U为酶活力(U/mg)；A为酶解底物的吸光度；A0为对照组的吸光度；V为酶解体系的总体积(mL)；t为反应时间(min)；n为稀释倍数；m为酶中蛋白质的质量(mg)[21]。

Ca3(PO4)2-PLE杂化纳米花酶活的测定：通过凯氏定氮仪测定Ca3(PO4)2-PLE杂化纳米花的实际蛋白含量，取与上述液酶相同蛋白含量的杂化纳米花，用2mL柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液(pH6.4)振荡悬浮后，用双蒸水稀释3000倍。采用与液酶相同的测定方法及公式对其酶活进行测定。

1.4 Ca3(PO4)2-PLE杂化纳米花水解菊酯类农药

取66μL菊酯类农药(100mg/L)溶于1.25mL 缓冲液中(农药质量浓度为5mg/L)，加入由1.8mg猪肝酯酶制成的Ca3(PO4)2-PLE纳米花，置于47℃水浴中反应20min，加入160μL四氯化碳旋涡振荡5min后静置分层，取下层四氯化碳提取液40μL，氮气吹干并加入40μL乙腈复溶，用液相色谱对水解产物进行测定。

液相色谱条件：色谱柱为Sepax HP-C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为0.1%(体积分数)乙酸水溶液-乙腈(21∶79)，流速1.1mL/min；检测波长225nm，柱温25℃，进样量20μL。

2 结果与讨论

2.1 Ca3(PO4)2-PLE杂化纳米花的制备及表征

2.1.1Ca3(PO4)2-PLE杂化纳米花的制备将氯化钙溶液加入含有猪肝酯酶的磷酸盐缓冲液中，孵育12 h，得到白色絮状沉淀，即磷酸钙纳米晶体和猪肝酯酶自组装形成的Ca3(PO4)2-PLE杂化纳米花。如图1所示，Ca3(PO4)2-PLE杂化纳米花的合成包括猪肝酯酶与磷酸钙晶体的聚集成核阶段、生长阶段和组装成纳米花3个阶段。其中，成核阶段起着关键作用[17]。而Ca3(PO4)2-PLE杂化纳米花的形成可由其组成成分以及结构特征等因素反映，因此需对Ca3(PO4)2-PLE杂化纳米花作进一步表征[18]。

图1 猪肝酯酶杂化“纳米花”的合成示意图Fig.1 General diagrammatic illustration of synthesis of Ca3(PO4)2-PLE hybrid nanoflowers

采用扫描电镜(SEM)对制备的Ca3(PO4)2-PLE杂化纳米花进行形貌观察(图3)。由电镜图片可知，Ca3(PO4)2-PLE杂化纳米花的平均尺寸约为20 μm，呈圆形并由多层片层构成花瓣状，因此具有较高的比表面积，这可能是杂化纳米花酶比液酶具有更高酶活的原因之一。

2.2 制备条件的优化

Somturk等[22]的研究表明，不同的酶浓度和金属离子浓度均会影响杂化纳米花的表观酶活力。考察了猪肝酯酶的质量浓度对Ca3(PO4)2-PLE杂化纳米花形成的影响，发现猪肝酯酶的质量浓度为0.3 g/L 时杂化纳米花的酶活最高(图4A)，随着猪肝酯酶质量浓度的升高或降低，酶活力均降低，这可能是由于在相对高浓度的酶中，纳米花所有的花瓣严格地彼此嵌入，并且表面无空隙结构，而中等浓度的猪肝酯酶则能合成具有孔隙结构的相当均匀的球形杂化纳米花。当猪肝酯酶的质量浓度较低时，纳米花不能形成片层状结构[23]。因此，选择猪肝酯酶的质量浓度为0.3 g/L。

钙离子浓度也会影响Ca3(PO4)2-PLE杂化纳米花的结构(图4B)，这是因为在合适的Ca2+浓度(500 mmol/L)时，会形成较为均一稳定的杂化纳米花结构，而在较低的Ca2+浓度下，则不会形成杂化纳米花的结构，且当Ca2+浓度低至250 mmol/L时，酶活明显较低，随着Ca2+浓度升至500 mmol/L，酶活达到最高。之后，继续提高Ca2+浓度，Ca3(PO4)2-PLE杂化纳米花的酶活逐渐下降并在Ca2+浓度高于1 000 mmol/L时达到平稳，原因可能是过高的氯化钙浓度使Ca2+浓度相对猪肝酯酶达到饱和，不会参与到Ca3(PO4)2-PLE杂化纳米花的形成过程。

磷酸盐缓冲液浓度(5、10、20、30、40、50 mmol/L)、pH值(pH 6.0、7.4、8.0、9.0、10.0)以及温度对纳米花形成的形态影响不大，但对其酶活性仍有一定的影响。磷酸盐缓冲液的浓度为10 mmol/L时，Ca3(PO4)2-PLE杂化纳米花的酶活达到最高，过高的磷酸盐浓度会抑制Ca3(PO4)2-PLE杂化纳米花的活力。在pH 7.4和20 ℃时，合成的Ca3(PO4)2-PLE杂化纳米花具有最高的酶活。

2.3 酶活对比及对不同菊酯类农药的水解情况

在最优条件下，测定Ca3(PO4)2-PLE杂化纳米花和游离酶的酶活，Ca3(PO4)2-PLE杂化纳米花酶活为液酶的169%(图5A)。这可能是因为：Ca3(PO4)2-PLE纳米花的颗粒较小，比表面积大且表面具有较多的空隙结构，这些空隙可以增加酶和底物的接触面积；此外，纳米级包埋和猪肝酯酶的协同效应以及猪肝酯酶在Ca3(PO4)2-PLE杂化纳米花中形成的酶构象也综合提高了Ca3(PO4)2-PLE杂化纳米花的酶活[22，24]。

采用合成的Ca3(PO4)2-PLE杂化纳米花对氰戊菊酯、氟氯氰菊酯、甲氰菊酯、氯菊酯进行水解(图5B)，同时与液酶的水解情况进行对比，发现Ca3(PO4)2-PLE杂化纳米花对上述4种农药的水解效果均优于液酶。但对于不同种类的菊酯类农药，纳米花的水解效率不同，其中水解效果最好的氰戊菊酯比水解效果最差的氟氯氰菊酯的水解效率高26%，底物特异性的差异表明固定的Ca3(PO4)2-PLE杂化纳米花对于不同的拟除虫菊酯类农药可能具有不同的适用性。

2.4 Ca3(PO4)2-PLE杂化纳米花的循环使用性

为进一步验证Ca3(PO4)2-PLE杂化纳米花的可重复利用性，本实验选取氰戊菊酯进行循环水解实验。结果表明，Ca3(PO4)2-PLE杂化纳米花在第2次循环仍保持70%以上的回收效率。随着循环次数的增加，Ca3(PO4)2-PLE杂化纳米花的残留活性逐渐降低，6次循环反应后其活性仅为10%，这可能是由于每次循环后Ca3(PO4)2-PLE杂化纳米花在离心分离过程中的质量损失所致。在实际应用过程中，可考虑选择载体对Ca3(PO4)2-PLE杂化纳米花进一步固定，避免因循环过程中酶的质量损失而导致酶活降低。

3 结 论

本文表征了由Ca2+离子和猪肝酯酶合成的Ca3(PO4)2-PLE杂化纳米花的组成和形貌，并对其合成条件进行了优化。同时研究了该Ca3(PO4)2-PLE杂化纳米花在水解拟除虫菊酯类农药方面的应用，结果显示，Ca3(PO4)2-PLE杂化纳米花对Ⅰ型(氯菊酯)、Ⅱ型拟除虫菊酯(氰戊菊酯、甲氰菊酯、氟氯氰菊酯)类农药均有较好的水解效果。与游离猪肝酯酶相比，Ca3(PO4)2-PLE杂化纳米花显示出更高的酶活性和重复利用能力，在基于酶法检测菊酯类农药的样品前处理方面显示了巨大的应用前景。今后可利用Ca3(PO4)2-PLE杂化纳米花设计酶水解型传感器，即基于Ca3(PO4)2-PLE杂化纳米花对拟除虫菊酯类农药的良好水解能力，由得到的水解产物向相应的装置提供检测信号，再利用转换器将检测信号转换成可定量分析的光、电信号，从而实现拟除虫菊酯类农药的定量检测。