赖燕华，卢浥良，李焕威，王 予，林宝敏，林 云，刘 熙

(广东中烟工业有限责任公司 技术中心，广东 广州 510385)

卷烟产品是烟丝与卷烟辅材的集成产品，由于卷烟叶组配方、香精香料和加工工艺的不同导致卷烟烟丝具有更大的复杂性和多变性，所以对不同品牌卷烟的烟丝进行鉴别具有较大难度。随着市场对卷烟产品需求的不断提升，优质烟叶种植量和市场需求量的矛盾日益突出，在不断加大原料叶组中薄片和梗丝调配比例的情况下，卷烟特有的香味风格特征也被削弱。在此情况下，利用现代分析技术对卷烟产品进行深入分析，探究不同品牌卷烟烟丝的关键性化学成分含量分布对于品牌卷烟的维护具有重要意义。

硅烷化气相色谱法的原理是通过硅烷化衍生反应使三甲基硅烷基取代衍生对象的羟基、羧基、巯基、氨基及亚氨基的活泼氢，提高衍生对象的挥发性，将非挥发性物质转化为挥发性衍生物，可克服气相色谱对极性强、挥发性低、热稳定性差的物质不能直接进样分析的缺点[1]，从而扩大气相色谱的测定范围。烟草中含有羟基、羧基、巯基、氨基及亚氨基的化合物有醇类、有机酸、糖类、氨基酸等物质，其对烟草和卷烟的质量有重要影响。其中烟草中的有机酸占烟叶干物质总量的12%～16%[2],许多有机酸及其衍生物是烟草香味的重要成分，直接影响烟叶及其制品的质量。葡萄糖、果糖等糖类物质是烟草及烟草料液中的重要成分，在烟草制品中起黏合、加料、加香、产酸以及保润等作用[3]。丙二醇、丙三醇等多元醇类化合物能够保持烟草水分，可避免卷烟在保存过程中水分挥发造成的口感下降，减少加工过程中的糙碎，作为常用的保润剂在烟草中得到广泛应用[4-5]。氨基酸也是烟草中的一类重要化合物，对烟叶的香味品质有重要贡献。在烟草调制、醇化或发酵加工直至燃烧过程中，游离氨基酸与还原糖(或羰基化合物)之间发生酶催化及非酶催化的棕色化反应，生成多种具有烤香或爆米花香味特征的杂环类化合物[6]。因此，利用烟丝硅烷化成分对不同品牌卷烟烟丝进行鉴别具有可行性。

对于烟草中有机酸、糖类物质、氨基酸及丙二醇、丙三醇等保润剂成分的分析有多种检测方法[7-12]，上述成分在不同卷烟中的含量差异及对感官质量影响方面的研究也有一定进展。赖燕华等[13]采用逐步回归分析法建立了卷烟感官风格品质与有机酸之间的关系模型，发现异戊酸、丙二酸、苯乙酸和柠檬酸等有机酸对卷烟香韵表现或感官品质存在不同影响。甘学文等[14]以果糖和苯丙氨酸为原料制备中间体，研究了其在卷烟燃烧过程中卷烟香气成分及含量的变化情况，证实了果糖-苯丙氨酸中间体具有增强卷烟香气的作用。殷延齐等[15]对15种品牌卷烟烟丝中的游离态氨基酸含量进行了主成分分析和聚类分析，发现各种氨基酸的含量分布特征能反映不同品牌卷烟的特性。朱保昆等[16]的研究表明甘油、丙二醇等保润剂对卷烟产品的感官舒适度有显著影响。但利用烟丝硅烷化成分鉴别成品卷烟烟丝的报道较少。

本文采用硅烷化气相色谱-质谱(GC-MS)指纹图谱方法同时测定卷烟烟丝中的多种有机酸、糖类物质、氨基酸及丙二醇、丙三醇等成分，并根据化学模式识别原理，采用聚类分析和主成分分析法对各种卷烟进行了分类和比较，探索了利用烟丝硅烷化成分对卷烟品牌进行表征和区别的可能性。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent6890/5973GC-MS联用仪、DB-5MS色谱柱(60m×0.25mm×0.25μm)、Agilent7683自动进样器(美国Agilent公司)。

N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA，美国Regis Technologies 公司)；N,N-二甲基甲酰胺(DMF，德国CNW Technologies GmbH)；乙酸苯乙酯-D3(内标，纯度98%，加拿大CDN isotopes公司)；2-硫代巴比妥酸(纯度≥98.0%)，正十七烷(内标)、磷酸、焦谷氨酸、甘油酸(纯度均≥99.0%)，1,2-丙二醇、甘油、果糖、葡萄糖、蔗糖、苹果酸、柠檬酸、脯氨酸(纯度均≥99.5%)，购于美国Sigma-Aldrich公司；甘油酸钙盐、L-苏阿糖酸半钙盐(纯度99%，Aldrich公司)。

选取不同厂家3个牌号的市售烤烟型商品卷烟，共21个样品，其中品牌A卷烟9个(样品编号1～9)，品牌B卷烟6个(样品编号10～15)，品牌C卷烟6个(样品编号16～21)。

1.2 溶液的配制

内标溶液IS1:称取500mg 乙酸苯乙酯-D3，置于50mL容量瓶中，用二氯甲烷溶解并稀释至刻度。

内标溶液IS2:称取1500mg 十七烷，置于50mL容量瓶中，用二氯甲烷溶解并稀释至刻度。

提取溶液:准确移取2.0mL IS1内标溶液和2.0mL IS2内标溶液至100mL容量瓶中，用DMF和BSTFA溶液(体积比2∶8)稀释至刻度，得提取衍生溶液。

标准储备液:准确称量约80mg1,2-丙二醇、96mg脯氨酸、30mg甘油、450mg苹果酸、80mg 柠檬酸、90mg肌醇、1800mg 果糖、1800mg葡萄糖和250mg蔗糖，置于100mL棕色容量瓶中，加入超纯水溶解并稀释至刻度，得混合标准储备液。

1.3 标准工作溶液的制备

取10、25、50、100、200、500μL标准储备液，分别置于2mL色谱瓶中，用氮吹仪于室温下吹干，再加1mL提取衍生溶液，于70℃烘箱中衍生化反应30min，得到GC-MS分析标准工作溶液。

1.4 GC-MS条件

进样口温度:250℃；进样量:1μL；分流进样，分流比:30∶1；载气:氦气，恒流模式，流量1mL/min；程序升温:初始温度50℃，保持2min，以5℃/min升至110℃，保持2min，再以2℃/min升至190℃，保持15min，最后以20℃/min升至280℃，运行15min。电离方式:EI；离子源温度:230℃；传输线温度:280℃；扫描方式:全扫描(SCAN)和选择离子监测(SIM)，SCAN范围为35～1000。

1.5 样品处理

按照行业标准方法YC/T31[16]将卷烟样品制备成烟末，准确称取10mg烟末，置于2mL色谱瓶中，加入1mL提取衍生溶液，于70℃烘箱中进行提取和衍生化反应30min，冷却至室温后，取上层清液，用0.45μm有机滤膜过滤，转移至2mL干净色谱瓶中，得到GC-MS分析样品溶液。以各化合物的量与相应内标物量的比值为横坐标，目标物定量离子色谱峰的面积与内标峰面积比值为纵坐标，绘制标准曲线进行定量。

2 结果与讨论

2.1 烟丝的硅烷化GC-MS指纹图谱

按照“1.1～1.5”实验方法，得到了21个卷烟样品的硅烷化GC-MS指纹图谱，并通过标准谱库检索及标准品保留时间比对，共定性14种硅烷化化学成分(表1)，主要包括氨基酸、有机酸/无机酸、糖和多元醇。实验考察了DMF与衍生化试剂的比例、衍生化反应温度及时间的影响，确定DMF与BSTFA的比例为2∶8,衍生化反应温度和时间分别为70℃和30min，此时14种目标化合物的衍生化效果好且趋于稳定。3个不同品牌卷烟烟丝硅烷化衍生物的GC-MS指纹图谱见图1。

表1 卷烟烟丝的硅烷化化学成分信息Table 1 Information of the silanized chemical components in cigarette samples

*quantitative ion

由图1可知，脯氨酸、苏阿糖酸、葡萄糖的硅烷化衍生物均出现2个峰，而果糖的硅烷化衍生物出现3个峰。改变衍生化试剂的比例、衍生化温度及时间，脯氨酸、苏阿糖酸、葡萄糖和果糖的硅烷化衍生物仍出现2个或3个峰，说明并非衍生化不完全所致，而是由于这些物质存在多个异构体，与BSTFA发生衍生化反应后，不同异构体的衍生化产物在该色谱条件下实现了分离[7]。另外，每个样品的气相色谱-质谱分析时间达90 min，分析时间较长，且果糖、葡萄糖、蔗糖等出峰较晚的化合物含量较高，1,2-丙二醇、甘油、脯氨酸、磷酸等出峰较早的化合物含量相对较低。因此，综合考虑保留时间和含量等因素，确定以乙酸苯乙酯-D3和正十七烷为双内标进行定量分析。由图1可知，乙酸苯乙酯-D3和正十七烷与14种烟丝硅烷化成分实现了良好的色谱分离。由于内标物乙酸苯乙酯-D3的出峰位置和强度与1，2-丙二醇、脯氨酸、磷酸、甘油、甘油酸、苹果酸、焦谷氨酸和苏阿糖酸比较接近，因此可用于这些化合物含量计算；而正十七烷则用作果糖、柠檬酸、2-硫代巴比妥酸、葡萄糖、肌糖和蔗糖的内标物。14种目标化合物在3个品牌中均有检出，其中果糖(峰13、14和15)和葡萄糖(峰18和19)在3个品牌中的含量差异较大，品牌A的糖类含量明显较低，仅通过指纹图谱的直观比较，很难判断不同品牌烟丝的归属，因此需对指纹图谱数据做进一步分析。

图1 品牌A(A)、B(B)和 C( C)卷烟的烟丝硅烷化衍生物GC-MS指纹图谱Fig.1 GC-MS fingerprint of silanizing derivatives in cut tobacco of cigarette brands A(A),B(B) and C(C)1.1,2-propylene glycol(1，2-丙二醇)；2，6.proline(脯氨酸)；3.phenethyl acetate-D3(乙酸苯乙酯-D3,IS1)；4.phosphoric acid(磷酸)；5.glycerol(甘油)；7.glyceric acid(甘油酸)；8.malic acid(苹果酸)；9.pyroglutamic acid(焦谷氨酸)；10，11.threonic acid(苏阿糖酸)；12.heptadecane(十七烷,IS2)；13，14，15.fructose(果糖)；16.citric acid(柠檬酸)；17.2-thiobarbituric acid(2-硫代巴比妥酸)；18，19.glucose(葡萄糖)；20.inositol(肌糖)；21.sucrose(蔗糖)

应用本方法对1号卷烟样品进行重复性测试，按照“1.5”样品处理方法和“1.4”GC-MS条件平行测定5次，计算方法的相对标准偏差(RSD),结果见表1。14种化合物测定结果的RSD为1.5%～7.6%，表明本方法的重复性良好。

2.2 不同品牌烟丝硅烷化成分的含量分布

运用箱线图对3个品牌卷烟的烟丝硅烷化成分含量进行比较，图2列出了部分硅烷化成分的箱线图。14种烟丝硅烷化成分的分布情况如下:

①卷烟品牌B的烟丝脯氨酸含量上、下四分位跨度较大，其含量范围较宽，但卷烟品牌A、B的脯氨酸含量总体上明显低于品牌C；②卷烟品牌C的烟丝焦谷氨酸含量上、下四分位跨度较大，含量范围较宽，但总体上其烟丝焦谷氨酸含量低于品牌A、B；③3个品牌的烟丝磷酸含量上、下四分位均较为集中，总体上品牌B的磷酸含量大于品牌A、C；④甘油酸、苹果酸、苏阿糖酸、柠檬酸、果糖、葡萄糖、肌糖的含量呈现品牌A<品牌B<品牌C的趋势；⑤品牌C烟丝2-硫代巴比妥酸的含量跨度较大，总体上品牌A的烟丝2-硫代巴比妥酸含量低于其他两个品牌；⑥卷烟C的烟丝蔗糖含量明显高于其他两个品牌；⑦1,2-丙二醇和甘油含量在3个品牌间无明显差异。

2.3 烟丝硅烷化成分对不同品牌卷烟的区分能力

箱线图可以大致判断硅烷化成分在3个品牌烟丝中的分布，但无法明确区分不同品牌卷烟。为明确21个样品间的相似性和差异性，对其硅烷化成分含量进行标准化处理后，采用聚类分析法和主成分分析法进行分析，结果分别如图3、4所示。

由图3可知，当距离为1.0时，样品分为两类，品牌A卷烟(样品1～9号)独自聚成一类，距其他两个卷烟较远，实现了很好的区分。品牌B卷烟(样品10～15号)和品牌C卷烟(样品16～21号)距离相对较近，但在距离约0.6处相互区分开，各自聚为一类。聚类分析的结果表明，烟丝硅烷化成分可以很好地区分不同品牌卷烟。

21个样品的主成分分析结果表明，前2个主成分因子的累计方差贡献率为82%，其中第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)的方差贡献率分别为68%和14%，因此提取前2个主成分概括烟丝硅烷化的总信息量，对样品进行综合评价。由图4可知，21个样品在第一主成分和第二主成分构成的空间内聚为3类:样品1～9聚成第1类，样品10～15聚成第2类，样品16～21聚成第3类，3个品牌各自很好地区分，表明相同品牌的卷烟存在较好的相似性，而不同品牌卷烟的硅烷化成分存在较大差异，与聚类分析的结果一致。

图3 烟丝硅烷化成分的聚类分析结果Fig.3 Cluster analysis result of different cigarette brands based on the silanized chemical components in cut tobacco

图4 不同品牌卷烟烟丝硅烷化成分的主成分分析双图Fig.4 Principle component analysis bi-plot of different cigarette brands based on the silanized chemical components in cut tobacco

3类样品在PC1上的得分也呈现明显趋势:卷烟品牌A<卷烟品牌B<卷烟品牌C。结合14种硅烷化成分在第一主成分上的载荷，由图4可以看出:葡萄糖、甘油酸、果糖、肌糖、苹果酸、苏阿糖酸、蔗糖、柠檬酸在第一主成分上的载荷最大，其次为脯氨酸、磷酸、2-硫代巴比妥酸，焦谷氨酸在第一主成分上的载荷最小，表明品牌C卷烟烟丝中葡萄糖、甘油酸、果糖、肌糖、苹果酸、苏阿糖酸、蔗糖、柠檬酸的含量最高，品牌A卷烟烟丝中焦谷氨酸的含量最高，品牌B介于两者之间，与箱线图的分析结果基本一致。

因此可将3个品牌卷烟的烟丝硅烷化成分主要特征概括为:①品牌A除了焦谷氨酸含量较高外，糖类成分(葡萄糖、果糖、蔗糖、肌糖)、酸类成分(甘油酸、苹果酸、苏阿糖酸、柠檬酸、2-硫代巴比妥酸、磷酸)和脯氨酸含量均低于其他两品牌；②品牌C卷烟烟丝的糖类成分(葡萄糖、果糖、蔗糖、肌糖)、酸类成分(甘油酸、苹果酸、苏阿糖酸、柠檬酸)及脯氨酸含量最高；③品牌B卷烟烟丝中糖、有机酸、氨基酸的含量介于品牌A、C之间；④3个品牌卷烟烟丝中的保润剂成分(1,2-丙二醇和甘油)含量无明显差别。

聚类分析和主成分分析的结果表明，烟丝硅烷化成分可以很好地区分不同品牌卷烟。3个卷烟品牌的硅烷化成分差异主要在于糖和酸含量的不同，而糖和酸均是卷烟料液中常用的原料，其种类的选择、用量及协调性对料液的处理效果具有重要影响[17]。相同品牌聚成一类，可能是由于同一品牌厂家的烟叶库存结构相同，加之主流料液的应用，使得相同品牌产品烟丝糖、酸成分的含量及比例整体上具有相似性，导致同一品牌样品在聚类图及主成分分析图中聚成一团。反之，不同品牌卷烟由于各厂家的叶组配方和添加料液存在较大差异，因此烟丝中糖、酸的成分含量和比例差异大，使不同品牌卷烟可以很好地相互区分开。

3 结 论

本文运用硅烷化衍生化法对卷烟烟丝样品中的主要化学成分进行检测，得到了21个样品的硅烷化GC-MS指纹图谱，并通过箱线图、聚类分析及主成分分析对实验得到的烟丝硅烷化成分含量进行了处理。结果发现21个样品被分成3类，相同品牌聚成一类，而不同品牌卷烟样品在聚类分析树状图和主成分分析得分图中均能很好地相互区分，说明不同品牌卷烟的硅烷化成分存在较大的差异，表明烟丝硅烷化GC-MS指纹图谱可以有效表征和区分卷烟品牌，从而为卷烟品牌风味表征、质量评价及控制提供有益的参考。