陈敬潮　师江龙　张苏伟

[摘要] 目的 应用多参数流式细胞术检测急性白血病细胞表面CD抗原分子的表达水平，探讨AML和ALL中CD抗原的表达规律，为临床个体化治疗累积分子机制研究材料。 方法 应用流式细胞术检测44例急性髓细胞白血病患者和18例急性淋巴细胞白血病患者，以CD45/SSC设门，应用13种单克隆抗体对CD45弱表达的细胞群进行免疫分型，测定多种CD分子的表达率，并通过χ2检验比较不同的高表达CD分子的相关性。 结果 44例AML患者中表达且高表达CD33（79.6%），CD38（70.5%），CD117（52.3%），cyt-MPO（50.0%）；16例B-ALL患者中CD10（75.0%），CD19（81.25%）以及CD22（81.25%）阳性表达率较高；比较AML患者高表达CD抗原，结果显示CD33/CD38、CD33/cyt-MPO的抗原表达差异均有统计学意义（P<0.05）。 结论 不同的CD分子在急性白血病细胞上表达有差异性，或将为靶向治疗和临床个体化治疗提供有用的线索。

[关键词] 流式细胞术；急性白血病；免疫表型；CD分子；表达相关性

[中图分类号] R551 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2018）16-0135-04

[Abstract] Objective To detect the expression level of CD antigen on the surface of acute leukemia cell by multiparameter flow cytometry， and to explore the expression principle of CD antigens in AML and ALL， so as to accumulate molecular mechanism research materials for clinical individualized treatment. Methods 44 patients with acute myeloid leukemia and 18 patients with acute lymphoblastic leukemia were detected by flow cytometry. Based on CD45/SSC， 13 types of monoclonal antibodies were used to carry out immunophenotype of the cell population with weak expression of CD45， and expression rate of various CD molecules was determined. The χ2 test was used to compare the correlation of different highly expressed CD molecules. Results CD33（79.6%）， CD38（70.5%）， CD117（52.3%） and cyt-MPO （50.0%） were highly expressed in 44 patients with AML； the positive rate of CD10（75.0%）， CD19（81.25%）and CD22（81.25%） was higher in 16 patients with B-ALL； the high expression of CD antigens in the patients with AML were compared. The results showed that there was a statistically significant difference in the antigen expression of CD33/CD38 and CD33/cyt-MPO（P<0.05）. Conclusion Different CD molecules are differentially expressed on acute leukemia cells， or they will provide useful clues for targeted therapy and clinical individualized treatment.

[Key words] Flow cytometry； Acute leukemia； Immunophenotype； CD molecules； Expression correlation

急性白血病（acute leukemia，AL）根據FAB协作组（French-American-British Group）将AL分为两类，分别是急性髓系细胞白血病（acute myeloid leukemia，AML）和急性淋巴系细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）[1]。急性白血病是血细胞克隆性增殖引起的血液肿瘤，其特点为骨髓中造血细胞恶性增殖、分化阻滞和凋亡受抑，确切病因至今未明，病毒感染、物理与化学因素、遗传因素等都与血液肿瘤的发生有关。急性白血病病情发展很快，如果得不到及时的诊治随时可危及生命。传统的急性白血病的诊断主要是通过骨髓细胞形态学检查和细胞化学染色等方法进行，然而仍有部分病例由于细胞形态学不典型、细胞发育幼稚等而难以明确诊断和分型，而分化的抗原决定簇（CD），在白血病的免疫分型中有着极其重要的地位。CD分子作为免疫分型的表面标志物，在细胞表面的表达类型和水平可以作为细胞身份的证明。急性白血病细胞表面存在有特定种类的CD分子表达。多参数流式细胞术（multiparameter flow cytometry，MFC）对白血病、淋巴瘤以及白血病微小病灶残留病的检测非常重要。因此，应用流式细胞术对血液肿瘤进行免疫分型，对白血病的MICM诊断以及鉴别诊断均意义重大。

1 资料与方法

1.1一般资料

选择2014年1月～2017年12月期间我院血液科收治的急性白血病（AL）患者62例，诊断符合法美英协作组（FAB）及2008年世界卫生组织（WHO）的诊断标准。男37例，年龄17～86岁，平均46.8岁，女25例，年龄13～72岁，平均45.7岁。其中急性髓系白血病（AML）44例，根据FAB分型划分为M0 1例，M1 4例，M2 11例，M3 10例，M4 14例，M5 4例；急性淋巴细胞白血病（ALL）18例，其中B系淋巴细胞白血病16例，T系淋巴细胞白血病2例（因样本例数少，在此不涉及分析）。

1.2试剂和仪器

IntraPrep Permeabilization Reagent试剂盒，红细胞裂解液，以及cyt-MPO、CD3、CD13、CD33、CD34、CD117、CD38、CD10、CD14、CD19、CD20、CD22、CD64和HLA-DR等单克隆抗体购自美国贝克曼公司；BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra流式细胞仪。

1.3 实验方法

采取骨髓标本3 mL，肝素抗凝，于各检测管中加入相应单克隆抗体10 μL，并加入标本100 μL，振荡混匀，室温避光20～30 min后，加入红细胞裂解液（依说明书步骤溶血），混匀避光15 min后，通过流式细胞仪CD45/SSC设门对10000个细胞进行检测，通过Flowjo软件分析细胞的免疫表型和表达强度。

1.4 统计学方法

通过SPSS20.0软件进行数据分析。计数资料以率（%）表示，组间比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 不同CD分子在AML患者中的表达

44例AML患者中各CD分子抗原表达各有不相同，以表达百分比>20%为阳性表达，则cyt-MPO（77.3%），CD34（63.6%），CD33（84.1%），CD117（88.6%），CD38（79.5）在AML患者中表達较高（表1），将百分比>60%作为高表达[2]，则CD33（79.6%），CD38（70.5%），CD117（52.3%），cyt-MPO（50.0%）为高表达，提示这些CD分子在AML诊断中可能具有直接诊断意义，而其他CD分子中度表达或者低表达，可能无直接诊断意义，但若其异常表达则提示某些AML亚型，尤其是CD7分子的异常表达[3]。

2.2不同CD分子在B-ALL患者中的表达

16例B-ALL患者中各CD分子抗原表达也各有不同，以表达百分比>20%为阳性表达，则HLA-DR（81.25%），CD19（81.25%），CD22（81.25%），CD10（75.0%）在B-ALL患者中表达率较高（表2），将百分比>60%作为高表达，则CD19（68.75%），CD10（56.25%），CD22（50.0%）为高表达，结果提示这几种CD抗原在B型淋巴细胞白血病的诊断与鉴别诊断上具有重要意义。

2.3 高表达CD33与CD38、CD117及cyt-MPO在AML患者体内表达的相关性

将百分比>60%定义为阳性界限，由表1可知CD33、CD38、CD117和cyt-MPO表达率较高，分别进行CD33和CD38、CD117以及cyt-MPO的两两比较，结果显示CD33与CD38、cyt-MPO的抗原表达差异具有统计学意义（P<0.05），而CD33和CD117的抗原表达差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。

2.4 AML患者与ALL患者中CD分子表达的差异性

44例AML患者与18例ALL患者CD表面抗原相比较，以>20%为阳性表达，结果显示AML患者中CD33、CD117、CD13、以及cyt-MPO阳性表达率较高，而ALL患者则低表达或不表达；ALL患者中CD10、CD19、CD20以及CD22阳性表达率较高，AML患者则为低表达或者不表达；AML与ALL部分患者共表达CD34和HLA-DR。见表4。

3讨论

急性白血病是由造血干细胞恶性增殖导致的恶性克隆性疾病，尽管在过去几年治疗有了显著改善，但5年生存率仍然很低[4]。主要原因是治疗后体内存留一定的残留细胞，这是白血病致死的最主要的因素[5]。现在关于急性白血病的分型主要还是以形态学为主，然而形态学受人为因素较大，光镜下对细胞的识别能力有限，少数病例难以分型[6]。

免疫表型主要是从造血分化过程中产生的抗原决定簇的角度来分析白血病细胞克隆的特征以及分化阶段。虽然白血病细胞的形态不同，但其仍然表达正常细胞所具有的特异性抗原。另外，由于白血病细胞具有肿瘤细胞的特点，其抗原表达与正常细胞不完全相同，存在一定程度的异质性，因此其免疫表型也有其自身特点。这种异质性有助于对白血病做出更精确的诊断和分型。随着单克隆抗体的发展与使用，对急性白血病的分型、预后与指导治疗有了很大的提高。

本文采用流式细胞术对AML和ALL表面CD抗原分型，以CD45/SSC设门，因为其具有其他免疫分型不可替换的优势。由于CD45是白细胞表面的共同抗原，通过CD45设门后可以得到几乎没有杂细胞的白细胞或有核细胞。本实验检测多种CD分子在AL患者中的表达情况，结果显示不同的CD分子在同一个体中的表达差异较大，AML中主要表达以CD33、CD117、CD13及cyt-MPO髓系抗原表达为主，提示此四类抗原在判断白血病细胞是否来源于髓系上具有很高的诊断价值，与文献报道[7]基本一致。CD33作为髓系前体细胞的标志，同时在粒系和单核系中均有较高表达[8]。CD13除表达在髓系祖细胞上，还表达于成熟粒细胞。CD13和CD33可以被认为是识别髓系常见且敏感的抗原。cyt-MPO是嗜中性粒细胞中，由嗜中性粒细胞颗粒产生的过氧化物酶，也是髓样细胞的特异性标记物。它在粒细胞白血病细胞中高度表达，并在单核细胞白血病中表达降低，可用于粒细胞白血病的初步判断标志[9-12]。CD117是C-Kit原癌细胞的表面分化抗原，正常骨髓细胞阳性表达率低于5%。其主要在髓系祖细胞中表达。由于其仅在髓系白血病中表达，通常作为髓系特征性抗原标志[13-15]。据资料显示，ALL患者的CD117表达明显低于AML患者，其髓系特异性明显优于CD13和CD33。CD117的高表达有利于帮助鉴别髓系白血病与淋系白血病[12]。综上所述，CD13、CD33、CD117和cyt-MPO在所有类型的AML中均有高表达，且特异性较高。选择上述抗原有助于AML的分子免疫诊断。而B-ALL中主要是以CD10、CD19、CD20和CD22抗原表达为主，提示其在B淋巴细胞白血病诊断方面具有重要意义。

AML中CD33、CD38、CD117、cyt-MPO这些髓系抗原不仅阳性表达比例高，而且表达量也高，具有一定的稳定性，在AML的诊断、治疗和预后中具有一定的意义。此外，本实验还将AML患者中高表达的CD33/CD38、CD33/CD117和CD33/cyt-MPO进行配对χ2检验，比较其差异性，结果显示CD33/CD38、CD33/cyt-MPO的抗原表达差异有统计学意义（P<0.05），两者联合检测可以提高AML的诊断率，而CD33和CD117的抗原表达差异无统计学意义（P>0.05）。

综上，流式细胞术对白血病的诊断和免疫分型具有重要价值，但不能作为白血病亚型诊断的独立标准，必须结合MIMIC分型进行判断。尽管近年来随着单克隆抗体的开发和应用，免疫表型分析在评价白血病临床疗效方面具有一定的意义，但仍存在争议，因此仍需积累大量临床资料，规模化、多方位、多领域多中心研究，以确定某些与治疗效果相关的抗原，为临床个体化治疗提供有力证据。

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（收稿日期：2018-02-12）