李丹　杜德兵　袁容静　王德成

[摘要] 目的 利用T-SPOT.TB测定、结核菌素试验方法（PPD法）及结核蛋白芯片法进行儿童结核分枝杆菌的检测诊断比较，以评价各种不同方法在儿童肺结核诊断中的临床应用价值。 方法 回顾性分析2015～2017年宜昌市第三人民医院收治的疑似肺结核患儿108例，其中确诊肺结核患儿57例，非结核患儿51例，用上述3种方法分别检测108例患儿，统计分析三种方法在诊断儿童结核病的灵敏度、特异度，并比较T-SPOT.TB与PPD法及结核蛋白芯片法诊断儿童肺结核的准确度。 结果 T-SPOT.TB测定法、PPD法及结核蛋白芯片法检测儿童肺结核的灵敏度分别为87.72%、56.14%和52.63%；特异度分别为90.19%、66.67%和82.35%。 结论 T-SPOT.TB测定与PPD法及结核蛋白芯片法比较，具有快速、敏感性高和特异性强等优点，是临床儿童结核病快速诊断的有效检测方法。

[关键词] T细胞斑点试验；PPD皮试；基因芯片；儿童结核病；检测方法

[中图分类号] R529.9 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2018）16-0019-04

[Abstract] Objective To compare the application of T-SPOT.TB determination， tuberculin test method（PPD method） and tuberculosis protein chip method for the detection and diagnosis of mycobacterium tuberculosis in children， so as to evaluate the clinical application value of different methods in the diagnosis of pulmonary tuberculosis in children. Methods 108 children patients with suspected tuberculosis who were admitted to Yichang Third Peoples Hospital from 2015 to 2017 were retrospectively analyzed. Of these， 57 children patients were diagnosed as pulmonary tuberculosis and 51 were non-tuberculosis. The above three methods were used to detect 108 cases of children. The sensitivity and specificity of the three methods in the diagnosis of pediatric tuberculosis were statistically analyzed， and the T-SPOT.TB， PPD methods and tuberculosis protein chip method in the diagnosis of pediatric pulmonary tuberculosis were compared. Results The sensitivity of T-SPOT.TB determination method， PPD method and tuberculosis protein chip method in the detection of pulmonary tuberculosis in children were 87.72%， 56.14% and 52.63% respectively； the specificity was 90.19%， 66.67% and 82.35% respectively. Conclusion Compared with PPD method and tuberculosis protein chip method， T-SPOT.TB determination method has the advantages of rapidity， high sensitivity and strong specificity. It is an effective clinical detection method for rapid diagnosis of tuberculosis in children.

[Key words] T-cell spot test； PPD skin test； Gene chip； Tuberculosis in children； Test method

世界衛生组织（World Health Organization，WHO）的结核病2014年度报告提示，现在全球儿童结核病患儿有增多趋势，形势较严峻，不容乐观。近年来我国儿童肺结核病有明显上升趋势，由于目前我国对儿童肺结核病的特点及早期诊疗认知不足，且诊疗手段有限，重症儿童肺结核明显增加[1-2]。因此早期诊断且及时治疗儿童结核病是控制的关键。但是目前儿童肺结核早期诊断困难，漏诊率和误诊率高。为了让儿童肺结核病得到快速诊断，本文通过对儿童肺结核患者进行血清T-SPOT.TB测定、PPD 皮试及结核蛋白芯片检测，观察其对儿童肺结核的诊断价值，评价其临床诊断的意义。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取我院2015 年1 月～2017年12月肺结核或疑似肺结核患儿108 例，其中患儿的诊断、治疗均符合中华医学会儿科学分会呼吸学组《儿童肺结核的临床诊断标准和治疗方案》[3]并随访 6 个月；出院时最终诊断与入选时诊断相符。明确诊断的肺结核患儿57 例，其中男35 例，女22例，年龄1～14岁，平均9.5岁。其中非肺结核患儿51例，男33 例，女18例，年龄1～14岁，平均9.8岁。将51例非肺结核患儿作为实验对照组进行对比分析。排除标准：①合并自身免疫系统病变；②合并代谢系统病变者及其他病变者；③有抗结核药物使用史者；④有免疫类药物使用史者；两组研究对象年龄、性别比例及身体状况比较差异均无显著性（P>0.05），具有可比性。抽取入选者行卡介苗—纯蛋白衍化物（BCG-PPD）皮试检测。同时抽取空腹血液5 mL，血清标本应用血T-SPOT.TB检测和血结核蛋白芯片检测。该研究获得医院医学伦理委员会批准，所有受试患儿均已由儿童监护人签属知情同意书。入院后详细询问病史、采集患儿卡介苗接种史、既往患儿结核患者密切接触史、进行体格检查、影像学检查、免疫学及分子生物学、痰涂片找结核菌、痰培养结核菌等检查。

1.2 检测方法

1.2.1 T-SPOT.TB检测 采集受试患儿外周静脉血5 mL用肝素钠抗凝，使用试剂盒从外周血分离出单个核细胞，参照试剂盒使用说明书进行检测，并置于标准培养箱中孵育16～20 h，显色洗板后对斑点进行计数，设立阴阳性对照孔，结果判定标准[4-5]：阴性对照孔斑点数为 0～5 个，CFP-10 和ESAT-6抗原检测孔任一孔计数-阴性孔计数≥6判为阳性；如果阴性对照孔斑点数≥6，检测孔斑点数≥2倍阴性孔斑点数判为阳性。

1.2.2 结核抗体蛋白检测芯片的检测 应用蛋白芯片法检测所有血清标本，试剂盒、蛋白芯片阅读仪等检测仪器均由南京大渊生物技术工程有限公司提供，同一名检验人员按照说明书和相关规定在无菌条件下进行所有操作，完成后将芯片放入芯片识别仪，根据生物芯片检测软件按程序操作，不同抗原点阵的灰度值进行分析。该抗体检测蛋白芯片试剂盒采用基因工程表达的脂阿拉伯甘露聚糖（LAM）、结核菌重组蛋白抗原16 kD和38 kD蛋白检测待检血清中的抗体，若其中任何一种抗体阳性，则判断该病例结核分枝杆菌抗体阳性。若三种抗体检测均为阴性，则结果可判定为阴性[6]。

1.2.3 结核菌素纯蛋白衍化物测定 于患儿前臂掌侧皮内注射 TB.PPD 0.1 mol·L-1（5 U），72 h后观察注射部位的反应情况，并测量硬结直径（㎜）。PPD皮试结果判断：硬结直径（mm）<5 mm（-），≥5 mm（+），≥10～19 mm（++），≥20 mm或局部出现水泡、淋巴管炎、壞死溃破等为强阳性（+++）。

1.3 评价指标

以临床最终诊断结果作为金指标，敏感性、特异性按下列公式计算：敏感性=真阳性数/（真阳性数+假阴性数），特异性=真阴性数/（真阴性数+假阳性数）。评价各个试验方法的灵敏度、特异度，并进行两两比较。

1.4 统计学方法

采用SPSS18.0统计学软件进行分析。计数资料以%表示，采用χ2检验；P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 确诊或疑似肺结核患儿的检测结果

临床确诊为儿童结核病的57例中，T-SPOT.TB法阳性率87.72%，结核蛋白芯片法阳性率56.14%，PPD 法阳性率52.63%，临床确诊为非结核性疾病的51例中，T-SPOT.TB法阳性率9.81%，结核蛋白芯片法阳性率17.65%，PPD法阳性率33.33%，见表1。

2.2 T-SPOT.TB检测与PPD试验灵敏度、特异度比较

108例入选患儿中，根据结果可计算出T-SPOT.TB检测的灵敏度为87.72%，特异度为90.19%；可计算出PPD试验的灵敏度为56.14%，特异度为66.67%。见表2。T-SPOT.TB检测诊断儿童结核病的灵敏度（87.72%）显著高于PPD试验的灵敏度（56.14%）（P<0.05）；特异度（90.19%）显著高于PPD试验的特异度（66.67%）（P<0.05）。

2.3 T-SPOT.TB检测与结核蛋白芯片灵敏度、特异度比较

108例入选患儿中，根据结果可计算出T-SPOT.TB检测的灵敏度为87.72%，特异度为90.19%；可计算出结核蛋白芯片检测的灵敏度为52.63%，特异度为82.35%。见表3。T-SPOT.TB检测诊断儿童结核病的灵敏度（87.72%）显著高于结核蛋白芯片检测的灵敏度（52.63%）（P<0.05）；两种方法的特异度经χ2检验比较无统计学差异（P>0.05）。

2.4 联合试验

当T-SPOT.TB与PPD试验、结核蛋白芯片检测联合使用时，儿童结核病组57例中T-SPOT.TB检测阳性或结核蛋白芯片阳性或PPD试验阳性例数共53例，灵敏度诊断率达到92.98%（53/57），提示为了需要达到更高的诊断灵敏度时，临床上可将三种诊断试验联合使用，诊断效果更佳。

3 讨论

儿童肺结核是一个特殊的群体，其感染后患病率高，病情严重，预后差。儿童肺结核临床症状不典型，小儿结核无明显自觉症状，又不易对症状清楚准确地描述，很难与其他儿童肺部感染性疾病区别；肺结核特别是肺外结核的标本采集困难。结核病确诊手段依然是细菌学方法。但由于结核菌的遗传特性，使常规细菌学检查方法存在取材困难、灵敏度低、操作复杂，且结核培养周期较长，病原学诊断因此受限等缺点，使临床诊断小儿结核十分困难。目前，结核病由于其具有极强的传染性，早发现、早诊断、早治疗显得尤为重要。0～14 岁儿童由于其免疫力较低，初次感染结核分枝杆菌后就有可能发展成结核病，如未能及时发现并诊断极易发展成重症肺结核和肺外结核，晚期可引起严重的后遗症。如何早期诊断小儿结核是临床共同关注的问题[7-8]。PPD 试验虽然具有时间短、简便、价格便宜的优点，但由于受重症感染及患儿免疫力影响，在严重播散性结核病和免疫抑制儿童患儿中常表现为假阴性，且PPD检测不易排除卡介苗接种（BCG）与非结核分枝杆菌（NTM）感染，对检测的灵敏度、特异度影响较大，常导致误诊、漏诊。本研究显示结核病患儿PPD阳性率为56.14%，此受我国实行普遍接种卡介苗的影响，假阴性率高达33.33%，与小儿免疫力低有关，给临床诊断儿童肺结核带来很大的困惑。

结核蛋白芯片系统是以微孔滤膜为载体，利用微阵列技术将纯化的结核菌脂阿拉伯甘露糖（LAM）、蛋白38 kD和16 kD等三种抗原固相于同一膜片上，并利用微孔滤膜的渗滤、浓缩、凝集作用，使抗原抗体反应在固相膜上快速进行，再以免疫金作为标记物而直接在膜上显色，对其灰度值进行分析。LAM是分枝杆菌属细胞壁的重要组成部分，属特异性抗原，具有较强的免疫原性，其检测的灵敏度较高，但除结核分枝杆菌外，其他分枝杆菌也有LAM成分，因此其特异性相对较低。结核分枝杆菌38 kD 抗原与16 kD抗原是结核分枝杆菌所特有的抗原，与其他分枝杆菌和非结核分支杆菌不存在交叉反应，其诊断的特异性较高[9]。结核蛋白芯片法可分别检测结核菌的特异性细胞壁脂多糖 LAM 抗体、38 kD 抗体和16 kD 抗体，以便能快速诊断患者结核菌感染情况。本实验结果显示，结核蛋白芯片检测结核病患者的特异度为82.35%，灵敏度为52.63%，但诊断的灵敏度不够高，不能满足临床诊断需要。

T-SPOT.TB是近几年发展的一种快速准确新型免疫性的诊断结核的方法，具有取材方便、快速、灵敏度及特异性强等优点。当前欧美等发达国家均已将T-SPOT.TB试验列入结核病诊疗指南，成为替代诊断结核病的主要方法[10-11]。其原理是以结核菌特异性抗原ESAT-6、CFP-10为刺激原，刺激患者外周血单核细胞中活化的T细胞，使其释放 γ-干扰素，可以对能有效释放 γ-干扰素的 T 细胞进行定量，从而进行诊断机体是否对活动性结核感染。且其不受大多数非结核分枝杆菌和卡介苗的影响，且该检验24 h即可出结果，结果客观、准确，判断标准简单明确。国内研究表明T-SPOT.TB试验在疑似结核病患者、活动性肺结核及肺外结核及诊断中均具有较好的临床诊断价值[12-14]，也为儿童肺结核的高效诊断提供了新的思维方式。本研究表明，T-SPOT.TB诊断儿童肺结核灵敏度87.72%，特异度90.19%，与国内外研究结果比较一致[15-16]，显著高于PPD试验灵敏度及特异度（P<0.05），提示T-SPOT.TB检测诊断儿童肺结核病的显著优势在于灵敏度及特异度均较高，且不受BCG接种大多数和非结核分枝杆菌影响，诊断价值较高。本实验血清T-SPOT.TB检测对儿童肺结核患者的灵敏度与结核蛋白芯片检测比较，差异有统计学意义（P<0.05），与结核蛋白芯片检测相比，特异度差异无统计学意义（P>0.05）。本研究结果表明，与结核蛋白芯片法及PPD 法比较，T-SPOT.TB法诊断儿童结核病，具有快速、敏感性较高和特异性强等优点，是辅助诊断儿童结核病的重要依据，具有一定的参考价值。

儿童肺结核早期诊断困难，晚期易引起严重的并发症及后遗症，因此，早期诊断或鉴别诊断意义非常重要。为了更好提高儿童结核病的诊断灵敏度，将以上三种诊断试验联合应用是更好的选择。

[参考文献]

[1] World Health Organization. Global tuberculosis contron-trol：WHO report 2014[R]. Geneva： World Health Organi-zation，2014.

[2] World Health Organization. Global tuberculosis report 2015[R]. Geneva：World Health Organization，2015.

[3] 中华医学会儿科分会呼吸学组，《中华儿科杂志》编委会.儿章肺结核的临床诊断标准和治疗方案（试行）[J].中华儿科杂志，2006，44（4）：249-251.

[4] Jonnalagadda S，La Course SM，Otieno P，et al. Incidence and correlates of tuberculosis IGRA conversion among HIV-infected postpartum women[J]. Int J Tuberc Lung Dis，2015，19（7）：792-798.

[5] 章淑梦，周华，符一骐，等. γ干扰素释放试验在活动性结核病诊断中的临床价值[J].中国结核和呼吸杂志，2014，（37）：372-373.

[6] 黄绍梅，邱薇，许柳清. 蛋白芯片法检测结核抗体在儿童结核病中的诊断价值[J]. 广东医学，2012，33（16）：2421-2422.

[7] 卢水华，肖和平. 结核病诊断新技术及其评价[J]. 中国实用内科杂志，2015，35（8）：9-12.

[8] WHO Guidelines Approved by the Guidelines ReviewCommittee. Guidance for National Tuberculosis Pro-grammes on the Management of Tuberculosis in Children[M].2nd edition. Geneva：World Health Organization，2014.

[9] 吳友根，杨兴萍，王军，等. 结核蛋白芯片检测诊断结核病的价值[J]. 中华感染与化疗杂志，2014，（14）：196-198.

[10] Yan L，Xiao H，Han M，et al. Diagnostic value of T-SPOT. TB interferon-γ release assays for active tuberculosis[J]. Exp Ther Med，2015，10（1）：345-351.

[11] 刘红黄，永杰，王静，等. 结核感染T细胞斑点试验在疑似结核病患者诊断中的价值研究[J]. 中国结核和呼吸杂志，2014，（37）：192-195.

[12] Pai M，Denkinger CM，Kik SV，et al. Gamma interferon release assays for detection of Mycobacterium tuberculosis infection[J]. Cli Microbiol Rev，2014，27（1）：3-20.

[13] 葛燕萍，肖和平. γ干扰素释放试验与结核菌素皮肤试验辅助检测肺外结核病的比较[J].中国防痨杂志，2014，36（3）：194-197.

[14] 贾红彦，潘丽萍，刘菲，等. 结核分枝杆菌感染T细胞斑点试验对淋巴结结核的辅助诊断价值研究[J]. 中国防痨杂志，2014，36（6）：467-471.

[15] Li T，Bao L，Diao N，et al. Influencial factors of the per-formance of interferon-γ release assays in the diagnosis of childhood tuberculosis[J]. Clin Exp Med，2015，15（3）：303-309.

[16] 孙琳，田建岭，尹青琴，等. γ干扰素释放试验在不同年龄活动性结核病患儿诊断中的应用价值[J]. 中国防痨杂志，2015，37（7）：757-763.

（收稿日期：2018-02-08）