张瑞霞，李海峰，冯迎娥，李静

（1.河南省安阳农业科学院，河南 安阳 455000；2.河南省安阳市汤阴县五陵镇人民政府，河南 安阳 455000）

近年来南瓜作为一种具有天然营养与保健功能的蔬菜，得到了人们越来越多的重视，特别是对于南瓜育种的研究。近年来，随着生物技术育种的不断发展，常规育种的不足在实际工作中日渐明显，而单倍体育种因其能通过直接加倍得到纯合二倍体受到了科研工作者的青睐。南瓜为异交植物，天然杂交率高，在常规育种中利用自交的方法获得一个纯系需要多代繁育，从而使育种、杂种一代的利用和良种繁育工作加长了周期和应用年限，而单倍体育种正好可以弥补这点不足，但由于影响因素较多，所以单倍体育种还未得到广泛的应用。为了进一步加快南瓜育种进程以及使单倍体育种应用于南瓜生产，本试验以葫芦科南瓜属中的南瓜优选自交系10-4-25的花药为试验材料进行花药培养，通过正交设计试验，旨在对影响南瓜花药培养的因素及培养中出现的褐变、污染现象作初步研究，从而为南瓜属蔬菜单倍体育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为南瓜优选自交系10-4-25（100粒种子），由安阳市农科院提供。于2017年春季定植于安阳农科院实验基地。

1.2 试验方法

1.2.1 培养基设计

选用MS培养基和MS-N培养基，两种培养基均附加蔗糖3%、琼脂0.6%以及外源激素NAA、6-BA、2,4-D，pH值均为5.8。其中MS-N培养基配制时去掉了NH4NO3、KNO3等元素。试验设计了9组激素配比方案，进行最优激素组合试验，每组5个培养皿。

1.2.2 花药消毒与接种

试验采用0.1%HgCl2和2%次氯酸钠两种消毒剂对南瓜花药进行消毒处理。从田间采集南瓜花蕾（长2.93cm、粗0.89cm），将花蕾置于黑暗条件下，分别低温（4℃）预处理24h和48h。用75%酒精浸泡30s后，取出用无菌水清洗1～2次，放入0.1%HgCl2中消毒7min或放入2%次氯酸钠中消毒10min，然后取出再用无菌水冲洗4～5次。在无菌条件下，剥去花瓣，将花药分别接种于预先配制好的MS培养基和MS-N培养基中，每瓶接种2个花蕾的花药。接种方式为将花药平放于培养基上，让花药与培养基充分接触。花药接种后，放入培养室内进行培养，培养温度为25～28℃，培养3d后开始观察。

2 结果与分析

2.1 不同消毒试剂、消毒方法对花药培养的影响

在南瓜花药培养中，只有灭菌彻底才能将培养工作进行下去。前人的工作大多是采用0.1%HgCl2灭菌，由于南瓜花蕾大，且雨后采集的花蕾更易受污染。本试验对比了不同消毒剂、消毒方法对花药培养的影响，结果见表1无论采用何种消毒剂，用手剥取花药消毒的感染率最高，直接消毒花药的次之，用刀划开花蕾取出花药消毒的最低。另外，0.1%HgCl2消毒7min，污染率高，且效果较差；用2%次氯酸钠消毒10min，污染率低消毒效果也较好。

2.2 培养基对花药培养的影响

不同培养基对花药培养的影响，结果见表2（见下页）。由表可以看出：MS培养基出现愈伤的效果好于MS-N培养基，MS培养基的褐变率高于MS-N培养基，为50.7%，MS-N培养基虽然褐变率相对较低，但是却发现接种后的花药出现了直接发白死亡的现象。初步分析，这种现象可能是培养基中缺少有利于植物生长的氮元素的缘故。这方面的研究工作还有待于进一步的深入。

表1 不同消毒试剂、消毒方法的比较Table 1 Comparison of different disinfection reagents and disinfection methods

表2 不同培养基对花药的影响Table 2 Effect of different media on anther

表3 不同培养组合对花药的影响Table 3 Effects on anther of different culture combinations

2.3 不同培养基组合的影响

试验设计，共设计了9组试验组合。试验过程中根据实际条件设计了每组5个培养皿，共45个培养皿，且每组的前2个培养皿所用培养基为MS培养基，后3个培养皿为MS-N培养基。

根据表3的9组组合方案两种培养基进行花药培养试验，结果表明：组合5的方案较好，接种于MS和MS-N培养基上的花药均出现了愈伤（但随后该愈伤发生了褐化死亡），按其他组合方案将花药接种于不同的培养基后虽也有个别愈伤出现，但总体表现为不同程度的褐化现象，这可能与培养基中的无机盐成分、蔗糖浓度和激素浓度有关。

2.4 外植体不同预处理时间对花药培养的影响

表4显示了不同预处理方法对南瓜花药的影响，由表4可知，经低温（4℃）预处理24h、48h后，用南瓜花药进行培养，都能出现一定的膨大现象。经过低温预处理24h和未经任何预处理的花药获得的愈伤组织诱导率基本上为0。48h的低温预处理，经过12d的培养后，有4个花药长出了愈伤组织。随着培养时间地延长，膨大后的花药逐渐变褐，其中有些花药接种后直接发白死亡。

由此可以看出，处理时间越长，诱导率越高，但是褐化也越严重。因此要注意选择适宜的预处理时间，从而来提高外植体的存活率。

表4 不同预处理对花药的影响Table 4 Effects of different pretreatment on anther

花药在离体培养前进行低温预处理，适宜的低温预处理可以提高愈伤组织和胚状体的形成，并进一步促进植株的再生。在4℃低温条件下，分别进行预处理24h、48h以及未经任何预处理3种方案的研究表明，4℃、48h的预处理方式中发现，MS培养基和MS-N培养基中均出现了花药愈伤组织，但随着培养时间的延长，花药逐渐变褐，直至死亡。因此，对于低温预处理的合适时间和合适温度尚待继续深入研究。

3 小结

3.1 南瓜花药培养中愈伤组织诱导率偏低

从试验结果来看，不同的材料、不同的培养基中南瓜花药总体诱导率还是比较低的，这是一个普遍问题，也是现在国内外众多学者的主要研究方向[4,5]。对于本试验，材料是一个花培中未曾研究的新基因型，因此，对培养基、附加成份的反应都是不确定因素，尽管我们也筛选了提高南瓜花药培养愈伤组织的诱导频率的激素种类和激素组合，但其最高诱导率仍不到1%，因此，这方面的技术还有待于进一步的探讨。

3.2 南瓜花药培养中褐化现象普遍

花药培养中的褐化问题一直以来都是相当普遍的，一般来说，外植体材料中单宁类和多种羟酚类化合物含量高的品种易引起褐化。试验表明，MS培养基的褐变率高于MS-N培养基，为50.7%，这可能与培养基的无机盐成分、蔗糖浓度和激素浓度等有关，因此，在初培养阶段，应该注意选择适宜的无机盐成分、蔗糖浓度和激素浓度。另外，正确选择消毒剂浓度及消毒时间，也能保证较高的外植体存活率[6]。