涂志华，周 知，马 宁，吴 忠，黎业娟，王安国，阮海玲，赵立强，胡嘉嘉，王 洁

(海南省妇幼保健院:1.生殖医学中心;2.检验中心，海口 570206)

珠蛋白生成障碍性贫血(thalassemia)是由于珠蛋白基因发生缺失或突变而导致的一组溶血性贫血，可遗传；以α-珠蛋白生成障碍性贫血和β-珠蛋白生成障碍性贫血为主要类型[1]。α-珠蛋白生成障碍性贫血又根据其基因改变类型的不同，分为缺失型α-珠蛋白生成障碍性贫血和非缺失型α-珠蛋白生成障碍性贫血[2]。地中海沿岸国家及东南亚各国、非洲均是珠蛋白生成障碍性贫血高发区，就十年前WHO统计，全世界就有约3.5亿人携带珠蛋白生成障碍性贫血基因[3]。聚合酶链反应-反向点杂交法(PCR-RDB)针对基因突变区域，设计特异性探针置于尼龙膜等介质上，PCR体外扩增基因突变DNA片段，同介质上的探针杂交并显色，能够进行多个靶基因并行检测，可用于批量检测，是临床上检测非缺失型α-珠蛋白生成障碍性贫血的主流方法。中国珠蛋白生成障碍性贫血人群Hb Westmead(Hb WS)、Hb Quong Sze(Hb QS)、Hb Constant Spring(Hb CS)3种常见非缺失型α-珠蛋白生成障碍性贫血大多采用PCR-RDB法检测[4]。我国南方珠蛋白生成障碍性贫血高发，特别是广西、广东、海南，各级政府每年需支付数以亿计的群体筛查费用。笔者希望可以建立一种针对珠蛋白生成障碍性贫血群体筛查的方法，基于PCR-RBD技术，将适量例数的DNA标本混合成1例检测的非缺失型α-珠蛋白生成障碍性贫血基因批量检测的方法，以缩减珠蛋白生成障碍性贫血群体防控经费，现报道如下。

1 资料与方法

1.1标本处理 取患者静脉血3 mL，置入抗凝管内。采用全血DNA快速提取试剂盒(亚能生物技术有限公司)，运用柱式分离法，提取抗凝血中的DNA。

1.2PCR-RDB 采用非缺失型α-珠蛋白生成障碍性贫血基因突变检测试剂盒(亚能生物技术有限公司)进行检测，仪器采用ABI 9700型PCR仪。严格按照说明书操作，每批设置阳性、阴性对照。检测限相关最大标本数检测实验：随机抽取临床标本10例，分别稀释3、6、12倍，经PCR-RDB检测，观察结果。

1.3干扰实验 验证非缺失型α-珠蛋白生成障碍性贫血基因DNA标本之间、与健康人标本之间会否相互干扰检测结果。3种非缺失型α-珠蛋白生成障碍性贫血标本间干扰实验：随机选取Hb WS、Hb CS、Hb QS的DNA标本各1例，等量混匀，经PCR-RDB检测后观察结果，进行3次重复实验。非缺失型α-珠蛋白生成障碍性贫血标本与正常标本间的干扰实验：随机选取Hb WS、Hb CS、Hb QS两类标本各1例，与正常标本1例，等量混匀，经PCR-RDB检测后观察结果，进行3次重复实验。健康人标本之间的干扰实验：随机选取健康人DNA标本3例，等量混匀，经PCR-RDB检测后观察结果，进行3次重复实验。

1.4数学模型建立 设某地区初筛实验α-珠蛋白生成障碍性贫血基因阳性预测值为K，初筛阳性批标本量为N,每例非缺失型α-珠蛋白生成障碍性贫血基因检测费用为S,则该批标本标本常规检测费用为SN。剔除双缺失α-珠蛋白生成障碍性贫血DNA标本后，每次取A例DNA标本混成1例检测，混合样本有N/A例。每例混合标本为阳性的概率为KA(0≤KA<1)，如有混合标本检测出阳性，则需单独检测出现阳性的混合标本中的每1例，混合标本的检测次数为A+1。则检测结果阳性的批检测费用为：F阳=N/A×KA×(A+1)×S，混合样本检测结果阴性的概率为1-KA，检测结果阴性的批检测费用为：F阴=N/A×(1-KA)×S，批检测总体费用公式为：F总=F阳+F阴=N/A×KA×(A+1)×S+N/A×(1-KA)×S=SN×(KA2+1)/ASN、K相对稳定，F总随A变化而变化，故F总有最小值，该最小值对应的A值即混合标本检测费用最小的最适标本数。

1.5方法验证实验 选取2013年10月东方市珠蛋白生成障碍性贫血群体筛查中初筛为α-珠蛋白生成障碍性贫血阳性的标本50例，用建立的新非缺失型α-珠蛋白生成障碍性贫血批量检测方法进行检测，比对新方法与传统方法的检测费用。

2 结 果

2.1检测限相关最大标本数检测组结果 分别稀释3、6、12倍后DNA标本能检测出结果且与其确诊结果相同(图1)。

A：稀释3倍；B：稀释6倍；C:稀释12倍

图1稀释后Hb WS杂合子标本DNA基因检测结果

2.2干扰实验检测组结果

2.2.13种非缺失型α-珠蛋白生成障碍性贫血标本间干扰情况 Hb WS + Hb QS + Hb CS标本混合均能检测出结果且结果为混合突变总和的结果，如图2所示。

图2 Hb WS+Hb QS+Hb CS纯合子标本混合检测结果

2.2.2非缺失型α-珠蛋白生成障碍性贫血标本与正常标本间的干扰情况 2种非缺失型α-珠蛋白生成障碍性贫血标本+健康人标本混合均能检测出结果且结果为混合突变总和的结果(图3～5)。

图3 Hb WS纯合子+Hb QS纯合子+健康人标本混合检测结果

图4 Hb WS纯合子+Hb CS纯合子+健康人标本混合检测结果

图5 Hb QS纯合子+Hb CS纯合子+健康人标本混合检测结果

2.2.3健康人标本之间的干扰情况 健康人标本混合均能检测出结果且结果不受干扰(图6)。

图6 3例健康人标本混合检测结果

2.3新方法验证结果 以海南省东方市妇幼保健院送检标本验证新方法可行性。2013年海南省东方市试行的珠蛋白生成障碍性贫血防控实验室方案：育龄夫妇行血细胞分析、红细胞渗透脆性实验，血细胞分析结果红细胞平均体积(MCV)<82 fL和/或红细胞平均血红蛋白含量(MCH)<27 pg、红细胞渗透脆性实验≤60%，符合其中一项即进行血红蛋白毛细管电泳实验，电泳结果HbA2 ≤2.5%或HbA2>3.5%为阳性,夫妇双方只要一方血红蛋白电泳结果阳性，则夫妇双方定为高危人群，进行珠蛋白生成障碍性贫血基因检测。该群体筛查实验室方案下，海南省东方市珠蛋白生成障碍性贫血群筛初筛实验平均阳性预测值为14.58%，代入上述公式，可知每3例标本混合后检测，检测费用最低，为传统检测费用的77.07%。2013年10月批次α-珠蛋白生成障碍性贫血初筛阳性病例50例，剔除3例双重缺失型α-珠蛋白生成障碍性贫血病例，用新法检测，费用为原来的78.72%，以三级医院非缺失α-珠蛋白生成障碍性贫血基因检测门诊收费143元计算，该批α-珠蛋白生成障碍性贫血初筛阳性标本检测可节约3 043.04元。

3 讨 论

珠蛋白生成障碍性贫血又称地中海贫血，是由于珠蛋白基因发生缺失或突变，珠蛋白链合成减少或缺失，导致血红蛋白的α链/非α链比例失衡，而引起的一组隐性遗传溶血性疾病。轻者可无临床表现，重者以溶血性贫血为主要特征[5]。珠蛋白生成障碍性贫血早在1999年就被WHO人类遗传病计划列为在发展中国家开展人群预防的六大疾病之一。是我国最常见的遗传性疾病之一。珠蛋白生成障碍性贫血目前尚无有效又廉价的治疗方法，对该病进行群体筛查、降低珠蛋白生成障碍性贫血重症胎儿出生概率有重要的意义。

根据珠蛋白肽链合成受到抑制的类型，珠蛋白生成障碍性贫血可以分为α-珠蛋白生成障碍性贫血、β-珠蛋白生成障碍性贫血、γ-珠蛋白生成障碍性贫血和δβ-珠蛋白生成障碍性贫血等，其中以α-珠蛋白生成障碍性贫血和β-珠蛋白生成障碍性贫血为主要类型[6]。α-珠蛋白生成障碍性贫血是由于α-珠蛋白基因突变而引起α珠蛋白肽链的合成受到抑制而导致[7]，又可以根据其基因改变的不同，分为缺失型α-珠蛋白生成障碍性贫血和非缺失型α-珠蛋白生成障碍性贫血。缺失型α-珠蛋白生成障碍性贫血是由于α-珠蛋白基因大片段缺失引起，是α-珠蛋白生成障碍性贫血主要的类型；非缺失型α-珠蛋白生成障碍性贫血是由于α-珠蛋白基因发生了点突变或其调节序列发生突变如单碱基置换或一个或几个核苷酸的缺失或插入所致，占α-珠蛋白生成障碍性贫血比例较少。目前发现至少有六十多种α珠蛋白基因点突变可以导致非缺失型α-珠蛋白生成障碍性贫血的发生，其中大部分突变点位于α2基因，少部分位于α1基因，及极少数位于α珠蛋白基因簇上α1和α2基因外的地方[8]。中国南方人群中常见的3种α点突变位点Hb WS、Hb QS、Hb CS位于α2基因。

非缺失α-珠蛋白生成障碍性贫血基因的检测有基因测序、基因芯片、变性高效液相色谱技术(DHPLC)、单链构象多态性(SSCP),变性梯度凝胶电泳(DGGE)等技术，随着各国政府对珠蛋白生成障碍性贫血的日益重视，学者们用新方法进行α-珠蛋白生成障碍性贫血筛查、诊断的尝试多见报道[9]。而随着PCR技术的发现，结合PCR技术的点突变分析鉴定非缺失型α-珠蛋白生成障碍性贫血的方法成为检测技术的主流，1989年发明反向点杂交技术(RDB)后，该技术在检测突变的确定性上仅次于基因测序。PCR-RDB-个杂交反应能同时分析一份标本中可能存在的多种点突变[10]。

虽然珠蛋白生成障碍性贫血筛查诊断技术有多种选择，但大多检测费用昂贵，多是一例标本一份试剂一次检测操作，但每年有数以百万计的珠蛋白生成障碍性贫血筛查人群，政府在珠蛋白生成障碍性贫血防治项目上所需费用过于庞大，珠蛋白生成障碍性贫血群体防控要更好地开展，需要大幅提高珠蛋白生成障碍性贫血医疗资源利用率[11]。

α-珠蛋白生成障碍性贫血检测的主流产品多基于PCR-RDB技术，理论上只要模板DNA高于检测限2 ng/μL，PCR过程不会相互干扰，RDB阶段，PCR产物与探针结合有特异性，理论上也不会相互干扰。正常提取的DNA标本，浓度为10～50 ng/μL，2～5例标本混合，单个样本浓度2～25 ng/μL，对基因扩增没有影响。珠蛋白生成障碍性贫血筛查方法中初筛可以初分α-珠蛋白生成障碍性贫血和β-珠蛋白生成障碍性贫血，再经基因诊断，但是初筛不能区分α-珠蛋白生成障碍性贫血表型阳性标本为缺失型还是非缺失型，基因检测时需α-珠蛋白生成障碍性贫血的两种类型同时检测，中国人群非缺失型α-珠蛋白生成障碍性贫血比例较小，因此非缺失型α-珠蛋白生成障碍性贫血检测多为阴性，适量例数标本混成一例检测非缺失型α-珠蛋白生成障碍性贫血相当于一次实验可得出多例标本的结果,节省大量试剂、工时、仪器损耗、水电等。

现有的珠蛋白生成障碍性贫血筛查诊断技术，多是一例标本一次检测操作，针对大样本群体筛查批检测的改进方法，罕见报道。笔者建立了一种应用于珠蛋白生成障碍性贫血群体筛查的非缺失型α-珠蛋白生成障碍性贫血批检测方法，该法基于PCR-RBD技术，根据初筛实验α-珠蛋白生成障碍性贫血阳性预测值均值，概率推算费用公式，建立数学模型，并依此将适量例数DNA标本混合成一例进行非缺失型α-珠蛋白生成障碍性贫血基因检测。依据文献报道，推测中国人群非缺失型α-珠蛋白生成障碍性贫血仅占α-珠蛋白生成障碍性贫血的2%～11%[12]，珠蛋白生成障碍性贫血群体筛查时，理想状态下，阳性预测值按此数据计，根据新的批检测方法，套用费用公式，批检测费用仅为常规检测的30%～70%。

珠蛋白生成障碍性贫血群体筛查中应用该批检测方法可大量减少基因检测次数，缩减人工和试剂费用、仪器损耗等。中国每年珠蛋白生成障碍性贫血群体筛查人数以百万计，而基因检测费用昂贵，应用该法能大幅缩减珠蛋白生成障碍性贫血群体防控经费，极大提高医疗资源利用率和社会效益。