邢增术 张 冲 刘振湘 白志明

(中南大学湘雅医学院附属海口医院泌尿外科，海南 海口 570208)

近年来研究发现〔1～3〕，酪氨酸激酶受体(Trk)B在某些恶性肿瘤组织中过度表达，导致肿瘤细胞的增殖能力和侵袭转移能力明显提高，但其在膀胱癌增殖转移分子机制中的具体作用国内外未见报道。本研究探讨siRNA靶向沉默TrkB基因对膀胱癌细胞株T24生长和转移的影响及其分子机制。

1 材料和方法

1.1材料 (1)细胞株：人膀胱癌T24细胞购自中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。(2)主要耗材及试剂：超低黏附培养板购自美国Corning 公司；人重组脑源性神经营养因子(rhBDNF)购自美国R&D公司；Lipofectamin2000购自美国Invitrogen公司；委托广州锐博生物科技有限公司设计和合成siRNAOligo；一抗和二抗均购自美国Santa Cruz 公司。

1.2细胞培养 将膀胱癌T24细胞培养于含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养液，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞近90%融合时用胰蛋白酶消化传代。

1.3T24细胞的siRNA转染 TrkB(NTRK2)-siRNA1：上游5′-CCGUCACCUUGACUUGUCUTT-3′，下游5′-AGACAAGUCAAGGUGACGGTT-3′；TrkB(NTRK2)-siRNA2：上游5′-CCACGAACAGAAGUAAUGATT-3′，下游5′-UCAUUACUUCUGUUCGUGGTT-3′；TrkB(NTRK-2)-siRNA3：上游5′-GCGCUUCAGUGGUUCUAUATT-3′，下游5′-UAUAGAACCACUGAAGCGCTT-3′；阴性对照组：上游5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，下游5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。按Lipofectami-n2000进行转染，转染后48 h检测目的基因蛋白，选择敲低效率最高者留作进一步实验。

1.4吖啶橙(AO)/溴乙啶(EB)双染色法观察细胞失巢凋亡情况 将转染TrkB-siRNA的T24细胞和阴性对照细胞(转染NT-siRNA)分别置于6孔超低黏附性培养板中与浓度为100 ng/ml 100 μl的rhBDNF共悬浮培养72 h，分别收集两组细胞制成细胞悬液。按试剂盒说明操作后荧光显微镜下观察。

1.5MTT法检测细胞生长 于细胞对数生长期，收集转染TrkB-siRNA的T24细胞和阴性对照细胞(转染NT-siRNA)，分别制成细胞悬液后接种于96孔板，每孔加入浓度为100 ng/ml 100 μl的rhBDNF共培养。于培养第0、12、24、48、72、96 h时各时间点分别收获细胞，按MTT法在酶标仪上检测各孔的OD值，绘制生长曲线。

1.6软琼脂克隆形成试验检测细胞克隆形成能力 分别取对数期转染siRNA-TrkB的T24细胞和阴性对照细胞(转染NT-siRNA)，与浓度为100 ng/ml 100 μl的rhBDNF共培养在制备好的软琼脂6孔板中10 d，计数含50个细胞以上的克隆数，计算细胞集落形成率。

1.7Transwell小室法检测细胞侵袭能力 收集转染TrkB-siRNA的T24细胞和阴性对照细胞(转染NT-siRNA)，加入无血清培养基制成细胞悬液，接种于铺有Matrigel基质胶的Transwell小室上室，并加入rhBDNF；下室加入含20% FBS的RPMI1640培养基，培养24 h，棉签擦去上室未穿膜细胞，甲醇固定再予结晶紫染色，镜下随机5个视野(×100)拍照并计数穿过膜的细胞数。

1.8Western印迹检测蛋白表达 用RIPA裂解液裂解细胞蛋白，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，经十二烷硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后，低温恒压电转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脱脂奶粉封闭2 h，一抗4℃孵育过夜，加入山羊抗兔辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，室温下孵育1 h，电化学发光法(ECL)化学发光，与内参β-actin比较，Image J软件进行定量分析。

1.9统计学处理 用SPSS19.0软件进行t检验或单因素方差分析。

2 结 果

2.1靶向沉默TrkB基因siRNA序列的筛选 TrkB-siRNA转染T24细胞以敲低TrkB的表达，并通过Western印迹检测敲低效率，选择敲低效率最高的TrkB-siRNA3(图1)进行下一步实验。

图1 膀胱癌细胞株T24转染NT-siRNA或siRNA-TrkB 48 h后Western印迹

2.2siRNA靶向沉默TrkB基因对膀胱癌细胞株T24抗失巢凋亡能力的影响 沉默TrkB基因的T24细胞经悬浮培养后大量凋亡，多个视野可见晚期凋亡细胞，核染色质发橙红色荧光，呈固缩或串珠状，有时核碎裂散布于胞质中，只有极少量正常活细胞可见。而阴性处理组T24细胞经悬浮培养后亦有细胞凋亡情况，但多个视野下可见许多正常活细胞，核染色质着绿色并呈正常结构(图2)。表明siRNA靶向沉默TrkB基因后膀胱癌T24细胞的抗失巢凋亡能力明显下降。

图2 NT-SiRNA T24悬浮培养72 h AO/EB双染色荧光显微镜观察(×400)

2.3siRNA靶向沉默TrkB基因对膀胱癌细胞株T24增殖、克隆形成、迁移及侵袭能力的影响 与阴性处理组相比，靶向沉默TrkB基因后T24细胞的增殖、克隆形成、迁移及侵袭能力明显降低，差异均有统计学意义(均P<0.05)，见图3～6，表1。

与NT-siRNA组比较：1)P<0.05；同表1，表2图3 沉默TrkB对膀胱癌T24细胞增殖能力的影响

组别细胞增殖率(×100%,n=10)克隆形成率(%,n=6)迁移力(划痕愈合比,n=6)侵袭力(细胞个数/HP,n=6)NT-siRNA组5.54±0.3546.70±4.550.36±0.02101.00±11.20TrkB-siRNA组3.21±0.311)24.50±3.041)0.22±0.031)32.38±3.291)

图4 沉默TrkB对膀胱癌T24细胞克隆形成能力的影响(×200)

图5 沉默TrkB对膀胱癌T24细胞迁移能力的影响(×200)

图6 沉默TrkB对膀胱癌T24细胞侵袭能力的影响(×200)

2.4siRNA靶向沉默TrkB基因对膀胱癌细胞株T24磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)信号转导通路活性及上皮间质转化(EMT)相关蛋白的影响 与NT-siRNA组相比，靶向沉默TrkB基因后，T24细胞E-钙黏蛋白(cadherin)的表达水平明显提高，而N-cadherin、波形蛋白(Vimentin)表达水平明显下降，p-Akt及EMT 相关核蛋白扭曲蛋白(Twist)、Snail、Slug表达水平显著下降，差异均有统计学意义(均P<0.05)，见表2，图7。

表2 siRNA靶向沉默TrkB基因对膀胱癌细胞株T24 PI3K-Akt信号转导通路活性及EMT相关蛋白的影响

图7 沉默TrkB对T24细胞PI3K-Akt信号转导通路及EMT相关蛋白的影响

3 讨 论

膀胱癌是泌尿生殖系统最常见的肿瘤之一，因其具有起源多中心性，易复发、转移等生物学特性，经治疗后仍有30%的患者后期发生肿瘤侵袭和转移，成为威胁患者生命的最重要因素〔4〕。

TrkB与其配体BDNF结合可激活多个重要信号传导通路，包括PI3K-Akt途径、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径和磷脂酶C途径，这些信号通路与细胞凋亡、增殖和浸润转移关系密切〔5，6〕。特别是近来研究发现TrkB在多种肿瘤中高表达，提示TrkB可能作为一种原癌基因在肿瘤的发生和转移过程中发挥重要作用〔1～3〕。本研究结果提示TrkB基因可明显影响膀胱癌T24细胞的增殖及转移侵袭能力。为进一步了解TrkB影响膀胱癌T24细胞转移侵袭能力的可能分子机制，本研究发现靶向沉默膀胱癌T24细胞的TrkB基因后，不仅其PI3K-Akt信号转导通路的活性下降，而且EMT受抑制，使得细胞的增殖及转移侵袭能力明显下降。据研究〔7，8〕，BDNF特异性与TrkB的胞外区结合后可诱导胞内酪氨酸残基磷酸化，启动BDNF-TrkB信号转导通路，其下游的PI3K-Akt信号转导通路随之被激活，被磷酸化激活的Akt在下调促凋亡蛋白Bad、Bim表达的同时，上调抗凋亡蛋白Bcl-2 的表达，导致失巢凋亡抵抗的发生，赋予肿瘤细胞迁移到其他部位再次生长的能力。因此TrkB可激活PI3K-Akt信号通路使肿瘤细胞获得失巢凋亡抵抗特性，从而发生转移。EMT是大多数上皮性肿瘤发生侵袭转移的一个极其重要的初始步骤〔9〕。研究表明〔10〕，TrkB可经PI3K/Akt信号转导通路激活下游EMT相关核蛋白，如Twist、Snail、Slug和ZEB1，后者与核内E-cadherin 转录启动子结合，从而下调其转录表达，导致肿瘤细胞间黏附能力下降；而间充质标志物如N-cadherin、Vimentin表达上调，促使cadherin转换现象的发生，使得肿瘤细胞的迁移能力明显提高。这可能是上皮肿瘤发生侵袭和转移的细胞分子生物学基础。

综上，siRNA靶向沉默TrkB基因可通过下调膀胱癌T24细胞PI3K-Akt信号转导通路的活性进而抑制EMT，从而降低其增殖及转移侵袭能力。本研究为膀胱癌的治疗策略提供了新的依据。