李春燕 傅红梅 李嫣红 谭毅刚 刘 欣

世界卫生组织在1992年将同时耐异烟肼和利福平的结核病定义为耐多药结核病，耐多药结核病存在治疗周期长、高治疗成本和低治愈率等问题[1]。快速地对分枝杆菌异烟肼及利福平耐药性测定，对治疗方案的制定和结核病流行非常重要的意义。随着分子生物学的发展，开发出了多种快速、客观、准确的耐药基因检测新诊断方法，如线性探针技术、基因芯片技术及探针熔解曲线技术等[2]。

近年来已有一些实验室的研究分析熔解曲线技术对结核分枝杆菌耐药性的测定。本文从临床应用角度观察，对PCR熔解曲线法结果总结，以培养法药敏试验作为金标准，分析熔解曲线法检测利福平、异烟肼耐药性的敏感度和特异度,探讨其在耐药结核病的诊断意义和应用价值。

1 对象与方法

1.1 对象

纳入广州市胸科医院2016年6月-2016年11月住院期间痰涂片找到分枝杆菌的200例患者，其中男149例，女51例，年龄16～85岁，其中初治患者147例，复治患者53例。

1.2 方法

1.2.1 标本的收集 对以上200例患者痰涂片抗酸染色阳性的痰标本进行分离培养，使用BACTECTMMGIT960TM全自动分枝杆菌培养仪。痰标本分离培养按照中国防痨协会《结核病诊断实验室检验规程》[3]进行。

1.2.2 药敏试验 对分离培养出的菌株进行结核分枝杆菌的菌种鉴定并进行异烟肼、利福平等药敏实验，操作均按照中国防痨协会《结核病诊断实验室检验规程》进行。

1.2.3 PCR熔解曲线法检测利福平和异烟肼耐药性 按照PCR熔解曲线法结核分枝杆菌利福平耐药突变检测试剂盒(厦门致善生物科技股份有限公司)和异烟肼耐药突变检测试剂盒(厦门致善生物科技股份有限公司)说明书操作。简述如下：①配制PCR反应液。PCR反应液配液标准：取n×19.6 μl INH或RIF PCR Mix A和n×0.4 μl TB酶混合液加入到1.5 ml离心管中，振荡混匀，3 000 g离心数秒；另取n×19.6 μl INH或RIF PCR Mix B和n×0.4 μl TB酶混合液加入到1.5 ml离心管中，振荡混匀，3 000 g离心数秒。②样品提取及加样。液体培养基中生长的结核分枝杆菌取1 ml，10 000 g离心15 min，丢弃上清液并在250 μl TBDNA提取液中重悬细菌；封口膜封口，99℃加热20 min，14 000 g离心10 min，转移上清到新的1.5 ml离心管，上清为PCR扩增模版；用微量加液器向每支PCR薄壁反应管中加入相应提取样品或阴/阳性对照品5 μl；将加入模版的PCR薄壁反应管转移至PCR扩增区，放入PCR扩增仪进行PCR扩增和熔解分析。

1.2.4 统计学方法 熔解曲线法以培养药敏试验为金标准计算灵敏度和特异度，见表1。

表1 熔解曲线法和培养药敏试验比较

注：灵敏度=A/(A+C)×100% 特异度=D/(B+D)×100% 一致性=(A+D)/(A+B+C+D)×100%

使用统计分析软件SPSS19.0版进行统计学分析。以P<0.05为检验水平，对熔解曲线法和培养药敏试验检测结核分枝杆菌利福平、异烟肼的耐药性检测结果进行一致性检验。

2 结果

2.1 结核分枝杆菌核酸检测及培养菌鉴定结果

见表2。

表2 核酸检测及培养菌鉴定结果 (n)

2.2 分枝杆菌耐药基因检测的结果

PCR熔解曲线法检测结核分枝杆菌核酸阳性的病例共175例，其中初治患者134例，复治患者41例。

2.2.1 初治134例患者中，痰培养有结核分枝杆菌生长的有106例，此106例纳入一致性分析(见表3、表4)。

初治患者中痰培养药敏试验提示利福平、异烟肼均耐药(MDR)的共有7例，其中熔解曲线法检测利福平、异烟肼均耐药的6例，1例为利福平耐药而异烟肼敏感。

2.2.2 复治41例患者中，痰培养有结核分枝杆菌生长的有36例，此时36例纳入一致性分析(见表5、表6)。

表3 初治患者耐药性测定 (n)

注：R表示耐药S表示敏感

表4 初治患者熔解曲线法检测耐药的灵敏度,特异度,阳性预测值,阴性预测值 (%)

注：1)表示P值< 0.001

表5 复治患者耐药性测定 (n)

注：R表示耐药S表示敏感

表6 复治患者熔解曲线法检测耐药的灵敏度,特异度,阳性预测值,阴性预测值 (%)

注：1)表示P值< 0.001

复治患者中痰培养药敏试验示利福平、异烟肼均耐药(MDR)的有15例，其中6例PCR熔解曲线法检测出利福平、异烟肼均耐药， 6例PCR熔解曲线法检测利福平耐药异烟肼敏感，3例PCR熔解曲线法检测利福平及异烟肼均敏感。

3 讨论

结核分枝杆菌耐药性呈逐年上升趋势, 异烟肼和利福平作为主要抗结核一线药物, 其耐药性检测对于临床结核病药物治疗具有重要意义。根据本文临床观察分析，在初治患者中，PCR溶解曲线法与培养药敏法相比，熔解曲线法在分枝杆菌检测利福平和异烟肼耐药上具有很高的灵敏性和特异性，检测异烟肼、利福平耐药性的结果高度一致，PCR熔解曲线法可应用于临床利福平和异烟肼耐药的快速检测和筛查[4]。在复治菌阳患者中， PCR熔解曲线法检测结核分枝杆菌利福平耐药情况与培养药敏试验也高度一致，可应用于临床利福平耐药的快速检测和筛查。同时结果显示在初治患者中熔解曲线法检测出利福平耐药的共有8例，其中7例培养药敏为MDR，复治患者中熔解曲线法检测出利福平耐药的有15例，其中12例培养药敏为MDR。PCR熔解曲线法检测出利福平耐药，不排除耐多药可能，建议根据病情及时调整抗结核方案，尽早按耐多药结核方案治疗。

但是复治患者PCR熔解曲线技术检测异烟肼耐药性与培养药敏法相比，熔解曲线法检测检测出异烟肼耐药性的灵敏度只有35%，一致率只有55.56%。考虑可能原因：①复治的肺结核患者经反复使用含异烟肼方案抗结核治疗，治疗过程中药物选择压的作用下产生突变，出现一些核酸序列改变，有些核酸序列改变并不引起氨基酸改变；而熔解曲线法只是筛查核酸序列而不是氨基酸序列，有些不引起氨基酸改变的突变也会被判断为突变型，故报告为突变的结果并不绝对表示耐药。②结核分枝杆菌对异烟肼的耐药机制尚未完全明确，耐药突变所涉及的基因、位点、突变类型繁多，复治患者在治疗过程中出现的耐药突变更复杂，熔解曲线法仅检测结核分枝杆菌由ahpC启动子区(-44～-30以及-15～3位点)、inhA94密码子、inhA启动子区(-17～-8)位点和katG315密码子突变引起的耐药，由其他基因或者基因区引起的突变以及其他异烟肼耐药机制引起的耐药不能检测。探针未完全包含耐异烟肼结核分枝杆菌的基因突变区，为提高检测灵敏度还需覆盖更多基因突变区[5]。③本组复治患者的样本量较小，也是造成结果差异的原因，需要扩大标本量研究。根据结果对PCR熔解曲线检测耐异烟肼的复治患者，仍有异烟肼敏感可能，而熔解曲线检测异烟肼敏感的复治患者，也可能是耐药。故对于复治患者，检测到单纯异烟肼耐药，需结合临床疗效再判断；合并利福平耐药，考虑MDR，尽早予耐多药方案治疗。

本组中有部分痰培养阴性，考虑因实验室因素对细菌的损伤及细菌自身活性因素等多方面影响，痰培养可出现痰涂片阳性培养阴性(SPCN现象)[6]。部分培养阳性却没有药敏结果，考虑由于含杂菌或菌量较少不适宜药敏。PCR熔解曲线分析检测的是核酸序列，细菌的损伤及活性下降对结果影响较少，故探针熔解曲线分析更能准确的检测出结核分枝杆菌。结核分枝杆菌生长十分缓慢，培养药敏法需要较长时间才能获取药敏结果，常常造成MDR-TB 的传播和患者治疗的延迟[5]。而PCR熔解曲线分析技术检测能快速检测出结果，可在患者出院前提供了耐药检测的结果。与培养药敏试验相比, PCR熔解曲线检测技术在应用于结核分枝杆菌耐药的快速检测时有较高的阳性检出能力, 同时更加简便、快速[7]。

综上所述，与培养药敏试验相比，PCR熔解曲线法检测方法简单快速，准确性高，可用于初治患者利福平、异烟肼耐药性的快速检测和复治患者利福平耐药性的快速检测，并可用于MDR-TB快速筛查，可指导临床用药；但对复治患者异烟肼耐药检测灵敏度不够，为提高检测灵敏度还需覆盖更多基因突变区。