欧阳伟

摘 要 稻瘟病属于水稻种植中一种常见的病害，给水稻产量和质量造成了较多的不利影响，因此，需要科研人员从分析生物学角度出发，应用分子标记技术对发生稻瘟病水稻的抗瘟基因进行研究，借助于该种基因研制可以有效抵御稻瘟病的水稻品种，以此控制稻瘟病的发病率，实现水稻生产数量和品质的提高。基于此，对当前稻瘟病的发病原因、抗病基因的研究情况进行了概述，结合研究成果分析了分子标记的定义，种类，重点介绍了分子标记在稻瘟病研究中的应用。

关键词 稻瘟病；分子标记；基因；染色体；抗病

中图分类号：S435.111 文献标志码：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2018.12.096

水稻（Oryza sativa L.）是全球最重要的一种粮食作物，世界上有超过1/3的人口以水稻为主粮。在我国，有65%的人口也是以水稻为主要口粮[1]。由病原菌Magnaporthe grisea引起的稻瘟病是水稻最重要的病害之一，俗称水稻癌症。该病害严重制约水稻生产，在稻瘟病大爆发年份，发病重的区域可造成水稻减产，减产幅度可以达到40%～50%，甚至绝产[2]，而且会影响稻米品质。

在水稻生产过程中，为了减少稻瘟病病害对于水稻的影响，常采用种植优质水稻品种、化学农药法等手段进行防治，但由于药物使用量不合理、水稻种植环境恶化，导致稻瘟病变异速度较快，应用常规防治方法干预病菌效果不理想，水稻抗病菌能力严重下降，而且过量使用农药易导致环境污染问题[3]。根据目前的研究可知，抗病品种是防治稻瘟病最好的办法。鉴定和发掘更多的抗瘟基因，并对之进一步定位克隆，通过多基因聚合，获得持久的抗病品种，是现代育种家最直接的育种目标。

1 稻瘟病的研究现状

1.1 稻瘟病抗性基因的定位与克隆

20世纪80年代，日本学者Kiyasawa等用经典遗传学的方法鉴定出8个位点上的14个主效显性抗稻瘟病基因，包括Pik位点的Piks、Pikp、Pikh、Pikm和Pik，Pita位点的Pita和Pita2，Piz位点的Piz和Piz1，以及Pii、Pia、Pish、Pib和Pit等。随着分子标记水平的不断发展，稻瘟病抗性基因的定位及复制得到了较快发展，已发现有87个抗稻瘟病基因，87个基因分布在除第3染色体上的其他11条染色体上，并有成簇分布的趋势。其中，最大的3个基因簇分别位于水稻的第6、11、12染色体上。如第6染色体上已定位了14个抗性基因，第11染色体上定位了24个抗性基因，第12染色体上则已定位16个抗性基因。

1.2 稻瘟病产生的原因

稻孢菌（Pyricularia oryae）属于半知菌亚门，为水稻稻瘟病的主要病原菌。水稻感染稻孢菌后，会在水稻中进行分生孢子、附着孢、侵染性菌丝的产生与分裂等一系列的变化。其具体过程是：稻孢菌以菌丝体和分生孢子的形式在稻草和稻谷上越冬，当第二年气温回升到20 ℃左右时候，遇降雨就会萌发累积分生孢子。孢子的萌发主要集中在在夜间12点至第二天早上6点。接触到禾苗后，在合适的温度、湿度下就会侵染禾苗，使禾苗产生病害。

2 分子标记在稻瘟病研究中的应用

2.1 分子标记概述

该种技术包括细胞学标记、分子标记、形态学标记、生物化学标记等遗传标记形式，其中分子标记较其他方法优点较多：1）核酸，不局限于基因是否表达，不需要分析组织或器官特异性，不受季节环境的限制；2）遍及全部基因组，数量丰富，标记的数量不受限制；3）自然存在大量的等位变异，高多态性；4）共显性多，很容易鉴别出基因型与杂合基因性；5）检测手段方便快捷，良好的重复性；6）不影响目标形状的表达，不关联不良形状。

2.2 分子标记的不同类型

分子标记包含的多态性标志类型较多，主要有随机扩增多态性、简单重复序列、扩增片段长度多态性、长度片段多态性、染色体或基因组原位杂交（GISH），mRNA差别显示（mRNA DD），代表性差异分析法（RDA），任意引物PCR（AP-PCR），单引物扩增反映（SPARs）等。

2.2.1 随机扩增多态性技术（RAPD）

该技术使用时可以在聚合酶链式反应（PCR）作用下，对物质基因组的DNA进行扩增，最终获得PCR产物。该产物在生成过程中，DNA片段应用随机引物来扩增，之后与模板结合方向互补存在，保证结合位点具有较短的结合位置。RAPD技术具有以下优点：1）无须获得序列信息即可进行DNA片段的大量扩增；2）技术操作较为简单，采集样本数量少，技术应用成本支出较少；3）樣本遗传基因为显性。但是，应用该技术对样本进行处理，易导致样本中的纯合子、杂合子无法被鉴别出来，碱基大小相同但是序列不同的片段，不能分开进行处理。

2.2.2 简单重复序列（SSRs）

技术类型主要有（AC）n、（GA）n等，处于两端的序列为单拷贝，在PCR下对随机引物进行设计，在多次重复后，片段长度有着极大差异。技术在应用时，操作难度较低，便于工作人员直接操作，样本多态检验结果较为精确。水稻中含有数量庞大的简单重复序列，因此该技术的应用效果较好。在现阶段的研究中，Mccouch等人选择样本，进行了简单重复序列引物的开发，样本引物数量共计为2 414对，标记点位2 240个，经过技术应用样本标记数量有2 740个，之后再对样本进行遗传多样性、基因定位等分析可知有着良好的应用价值。

2.2.3 扩增片段长度多态性（AFLPs）与长度片段多态性（RFLPs）

长度片段多态性属于分子标记技术中最先被研究出的一种多态性标记形式，在遗传连锁领域中应用较多。技术应用时，可以直接破坏限制性内切酶识别位点，使得酶切片段可以在同一区域生成。应用特异性探针可以对存在差异的片段带型进行检测，遗传片段以显性遗传形式来表示，不具有表型效应，标记点在不同等位时，不会发生互相干扰情况。但此法应用的成本高，样本采集数量多，检测技术操作复杂，长时间进行同位素检测，易对工作人员造成人身损害。因此可以在该技术应用基础上，联合AFLPs技术来检测。

2.2.4 酶切扩增多态性序列（CAPS）

技术原理为对限制性内切酶识别位点进行检测，待位点出现丧失、重新生成时，需要使用引物重新设计位点。具体流程：DNA片段经PCR实现多态性位点的扩增，产生的产物应用限制性内切酶进行消解处理，酶切片段的大小应用电泳法来确定，该法多用来对样本的基因型信息进行检测。

2.2.5 候选基因技术（同源序列）（RGA）

对植物的抗病基因进行克隆，获得的产物中有蛋白激酶、核苷酸结合位点等结构域，用于识别细胞信号、蛋白质等物质，并对上述物质进行传导处理。在抗病基因克隆基础上对DNA片段进行扩增，得到的片段序列非常相似。科研人员在对马铃薯的抗病基因产物的研究中，在原来基因上利用引物合成了RGA片段。

2.3 分子标记在稻瘟病研究中的应用

稻瘟病的研究中，使用分子标记技术可以促使水稻充分发挥出抗病作用，有助于研究人员对抗病基因进行克隆处理。在抗病基因以往的研究中，长度片段多态性利用率高，但随着科学技术的发展，由于该技术存在检验操作难、结果得出时间长、检验费用和样本数量多、适用范围少等弊端，逐渐被简单重复序列等技术所取代，极大地提高了抗病基因研究的效率和质量，对于人体不会造成严重伤害，安全性高，在目前的植物疾病基因定位研究中应用广泛。

2.4 在水稻抗病基因育种中应用分析标记技术

为了提高水稻的种植质量，减少稻瘟病大面积暴发给农户造成的经济损失，需要不断推广与应用预防稻瘟病的水稻新品种培育方法。以往在品种培育时，多选择目标性状直接进行培育，获得的水稻品种种植效果好，但品种培育数量较少，培育时间较长，该法的应用效果不理想。因此水稻种植人员在育种时，可以学习分子生物的相关知识，了解分子标记技术在农产品、植物培育时发挥的重要作用，依托该技术进行抗稻瘟病水稻的育种工作。在水稻育种中，使用该技术手段可以选择水稻的隐性性状，在作物生长期间可以在各个阶段对DNA片段进行检验，分析片段是否发生变异以及变异的程度，是否有利于多基因聚合水稻的育种。该技术育种时的应用价值高，对于育种的操作要求较低，样本数量要求不多，成本可以得到有效控制，培育出的水稻新品种对于生长环境有着良好的适应性。因此分子标记技术需要在水稻抗病育种中大量应用，以此促进诸多水稻种植农户经济收益的提升。

3 展望

当今科技日益发展，特别是生物信息学领域更是迅猛发展。分子标记技术虽然开发的时间不长，但应用范围极广。分子标记技术的广泛应用最重要的限制因子是成本和利益，虽然从表面来看，分子标记花费的成本较传统形态学标记高，但随着分子标记在遗传学的广泛应用，各种标记分析技术已程序化而易于实施。分子生物学理论和技术的快速发展，必将不断开发出成本低、信息量大、应用范围广的分子标记技术。在稻瘟病研究领域，应用分子标记来定位抗性基因已經取得了显著成绩。但也存在一些不足，如稻瘟病抗性基因的定位群体与育种群体存在脱节，基因定位的成果难于直接应用到育种研究上。在以后的研究中应该加强：1）在稻瘟病定位研究中选用育种材料来构建定位群体，缩短基础研究与应用研究的距离；2）开发更多实用简单易操作的分子标记技术，进一步促进分子标记辅助育种在实践中的应用和推广。

参考文献：

[1] 康美花，曹丰生，陈红萍，等.水稻稻瘟病抗性基因研究进展及其在育种上的应用[J].江西农业学报，2010，22（2）：95-98.

[2] 崔永，刘自旭.水稻稻瘟病抗性基因的研究[J].山西农业科学，2008，36（12）：40-43.

[3] 李杨，王耀雯，王育荣，等.水稻稻瘟病菌研究进展[J].广西农业科学，2010，41（8）：789-792.

（责任编辑：赵中正）