徐　婷，易中梅，罗军梅，张　强，孟　强，喻荷莲，王世春，蒋天伦

(陆军军医大学第一附属医院输血科，重庆 400038)

慢性自发性荨麻疹(CSU) 是一种常见易复发的皮肤疾病，在任何年龄段均可发生，其临床症状表现为反复发作的水肿性红斑、风团，常伴剧烈瘙痒，给患者的日常生活造成了严重影响[1-3]。然而，这类荨麻疹的发生却难以找到确切的病因或诱发因素，这为CSU的临床治疗带来了不便和困难[4-6]。现有的研究表明，CSU的发生与抗人IgE高亲和力受体(FcεRIα)自身抗体存在密切的关系，但在临床上却未开展对该自身抗体的检测[7-9]。因此，本研究通过噬菌体展示技术制备人FcεRIα的单链抗体(scFv)并建立抗人FcεRIα自身抗体的快速检测方法，为慢性自发性荨麻疹的临床治疗提供有效的诊断依据。

1　材料与方法

1.1材料与仪器噬菌体随机线性12肽库(Ph.D.TM-12 Phage Display Peptide Library)，其滴度为1.0×1013噬菌斑形成单位(pfu)/mL；大肠杆菌E.coli ER2738、ER2766；测序引物(-96 g Ⅲ sequeneing primer)序列为 5′-CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3′，均购自美国New England Biolabs 公司；抗人FcεRIα抗体、HRP 标记的山羊抗人IgG均购自英国Abcam公司；噬菌体单链DNA提取试剂盒购自美国Axygen公司；Superdex 75层析柱购自美国GE Healthcare公司；3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)显色试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。

台式高速离心机购自德国Sorval公司；Biologic LP层析系统购自美国Bio-Rad公司；Hofer ΜV-25紫外透射仪购自美国Amersham Pharmacia公司；Multiskan MK3酶标仪购自美国Thermo公司;VT-1300L超净工作台购自成都苏净科学器材有限公司；恒温培养箱购自上海博泰科学器材有限公司。

1.2方法

1.2.1标本收集本研究经本院伦理学委员会批准，患者知情同意，从本院收集健康者和CSU患者标本各30例。CSU患者入组前需接受自体血清(50 μL)注射测试，以0.1 mg/mL的组胺和0.9%的生理盐水分别为阳性和阴性对照。注射30 min内，若风团直径>1.5 mm者为阳性反应，方可入组。若风团直径≤1.5 mm者为阴性反应，不可入组。

1.2.2scFv的生物淘选在96孔板中加入50 μg/mL抗人FcεRI抗体溶液于4 ℃孵育过夜→加入封闭液于4 ℃孵育2 h→TBST洗涤→加入2×1011pfu噬菌体溶液于室温孵育1 h→TBST洗涤→加入洗脱液(0.2 mol/L,pH2.2,Glycine-HCl)及中和液(1 mol/L，pH9.1，Tris-HCl)→取1 μL测滴度并将剩余液体扩增→扩增液于4 ℃ 12 000×g离心10 min→取80%上清液至新管中，加入1/6体积的2.5 mol/L、NaCl/20% PEG-8000(w/v)于4 ℃静置过夜→次日于4 ℃ 12 000×g离心15 min，去上清液→1 mL TBS重悬沉淀，重复离心1次→取上清液至新管中并加入1/6体积的PEG/NaCl冰浴1 h→4 ℃ 12 000×g离心10 min，去上清液→用含0.01% NaN3的TBS重悬沉淀→取1 μL测滴度，剩余液体用于下轮筛选。三轮筛选后，在菌斑数<100的平板上随机挑取48个分隔良好的噬菌斑按1.2.3的方法进行扩增。

1.2.3噬菌体的扩增将ER2738的过夜培养物用LB培养基进行1∶100稀释，按每管1 mL分装于50 mL的培养管中。用无菌牙签蘸取48个分隔良好的蓝色噬菌斑分别放入上述培养管中，37 ℃剧烈振荡培养4.5 h。将扩增好的噬菌体液体倒入离心管中，12 000×g离心1 min，重复1次。取80%的上清液于新离心管中，即为扩增的噬菌体液体。

1.2.4噬菌体阳性克隆的选择将噬菌体抗体加入96孔板中，加入2倍体积的封闭液(5 mg/L BSA)混匀，于室温静置30 min。取100 μL加入已包被抗人FcεRIα抗体的板条中，加底物TMB溶液显色15 min，以2 mol/L H2SO4终止反应，于波长450 nm下测定吸光值(A值)。设立1% BSA的包被孔为阴性对照，以A450值高于阴性对照2倍以上为阳性克隆。

1.2.5scFv序列测定将阳性克隆扩增培养后，按照噬菌体单链DNA提取试剂盒的操作说明进行操作，提取阳性克隆的DNA，采用1.1中的测序引物送上海生工公司测序。

1.2.6scFv的制备和纯化将阳性克隆转化到表达菌株ER2766中大量表达，通过Biologic LP层析系统对scFv进行纯化并进行酶联免疫吸附试验(ELISA)鉴定。

1.2.7抗人FcεRIα自身抗体的检测将scFv 50 ng/mL 100 μL包被于ELISA板上，4 ℃过夜并封闭，于板孔中加入1∶100稀释的健康者和患者血清标本，37 ℃孵育30 min；加入HRP 标记的山羊抗人IgG(1∶1 000) ，37 ℃孵育30 min；洗板后，每孔加入TMB 显色液100 μL，于37 ℃避光显色20 min，加入50 μL H2SO4(2 mol/L)，于20 min内测定A值。

1.2.8统计学处理采用SPSS19.0软件进行统计学分析，通过受试者工作特征(ROC)曲线确定检测的临界(cut off)值、特异度及灵敏度。

2　结　　果

2.1噬菌体12肽库的生物淘选结果通过噬菌体抗体库筛选技术，不但可以将目标分子从库中准确筛选得到，而且通过3轮扩增可以将目标分子进行富集。从表1可以看到，随着淘选轮数的增加，噬菌体产量也在增加，这说明与抗人FcεRIα抗体结合的噬菌体得到了富集。

表1　　噬菌体12肽库的生物淘选结果(pfu)

2.2噬菌体阳性克隆的检测随机挑取48个分隔良好的蓝色噬菌斑，并依次编号进行扩增纯化后，通过ELISA检测筛选得到12个阳性克隆，具体结果见图1。

图1　　噬菌体阳性克隆ELISA结果

2.3筛选肽的序列分析按试剂盒说明书提取上述12个阳性噬菌体的ssDNA，用-96 gⅢ测序引物进行测序，其中7个克隆的序列与抗人FcεRIα自身抗体的结合表位一致。

2.4表达克隆的选择将上述克隆分别转入表达菌株中进行表达，并将纯化后的scFv片段加入已包被抗人FcεRIα抗体的板条中进行ELISA检测。从图2中可知，A20的A值最高，说明它与抗人FcεRIα抗体的结合力最强，故选定A20为表达克隆。

图2　　噬菌体阳性克隆ELISA结果

2.5抗人FcεRIα自身抗体的检测将A20转化到表达菌株中大量表达纯化后，将scFv片段包被于ELISA 板上测定健康者和CSU患者血清中的抗人FcεRIα自身抗体，结果见图3。

图3　　检测抗人FcεRIα自身抗体结果

2.6ROC曲线分析将CSU患者的ELISA检测值作ROC曲线分析发现，当A值为0.635时，该检测方法的灵敏度为96.7%，特异度为100.0%，见图4。

图4　　ROC曲线分析结果

3　讨　　论

CSU给患者的日常生活质量造成了严重的影响，但至今对其发病机制仍不清楚，并且难以找到确切的病因或诱发因素，从而加大了临床治疗的难度[10-11]。传统的研究认为荨麻疹的发生是属于Ⅰ型变态反应，与IgE介导的肥大细胞及嗜碱性粒细胞活化，进而释放组胺、白三烯等活性物质有关。肥大细胞是IgE介导的超敏反应的主要效应细胞。在荨麻疹疾病中，活化的肥大细胞主要通过释放组胺及多种细胞因子和趋化因子来发挥作用[12]。然而，这种发病机制多见于急性荨麻疹，少见于慢性荨麻疹。

在部分慢性荨麻疹患者皮内注射自体血清后，注射部位周围可出现红斑和风团。由此表明，其血清中可能存在某些自身抗体能活化肥大细胞，从而释放活性物质，导致CSU的发生。这一研究发现提示具有功能性的自身抗体与CSU的发病存在着密切的关系[13-14]。随着研究的不断深入，在CSU患者血清中纯化的IgG 片段可以在体外诱导组胺的释放，并且这类IgG 抗体主要是针对IgE高亲和力受体α 链(FcεRIα) 的自身抗体，从而证实当IgG-抗FcεRI和IgG-抗IgE结合FcεRI或IgE后通过激活补体C5a促使肥大细胞脱颗粒并释放组胺，导致荨麻疹的发生[15]。因此，抗FcεRIα自身抗体的诊断对CSU在临床治疗过程中具有重要的指导意义。

目前，国内在临床上尚未出现抗FcεRIα自身抗体的商品化诊断试剂盒，严重影响了由抗人FcεRIα自身抗体所引起的此类疾病的诊断[16]。而现有的研究多数是先通过原核表达的方法获取FcεRIα蛋白，然后构建ELISA检测的方法，但是由于原核表达技术多表达的是全长蛋白，在ELISA检测过程中存在一定的交叉反应，从而使该检测方法的特异性达不到预期[17]。本研究采用噬菌体抗体库技术通过3轮“吸附-洗脱-扩增”来大量富积特异性克隆从而获得人FcεRIα的单链抗体。该单链抗体属于全人源性抗体，通过对其序列分析及氨基酸残基的优化能明显提高抗体的亲和力，而且获取过程简便、高效。另外，从本研究结果中可以看出，利用scFv来构建的抗FcεRIα自身抗体ELISA检测的方法，其特异度及灵敏度均较高，为抗FcεRIα自身抗体在临床上的诊断提供了可靠的理论依据。