方　娟,李文鲜,黄小兰

(重庆市渝北区人民医院检验科,重庆 401120)

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，占女性肿瘤的第一位，全世界乳腺癌的发病率呈现逐年升高趋势[1]。临床放化疗、靶向分子治疗、生物治疗在一定程度上提高了乳腺癌的治疗效果，大大提高了患者生活质量和生存期，但临床的三阴性[雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和原癌基因Her-2均为阴性]乳腺癌的治疗效果往往不佳，无有效的治疗手段，严重影响患者的预后[2-5]。

临床三阴性乳腺癌患者约占所有乳腺癌患者的20%。三阴性乳腺癌恶性程度高，侵袭转移能力强，患者预后往往不良，死亡风险很高。在传统的放、化疗等治疗手段效果不好的情况下，乳腺癌的生物基因治疗可能是最有效的手段。文献报道转化生长因子-β(TGF-β)/SMAD2/3信号通路在乳腺癌中处于激活状态，TGF-β信号通路的激活是乳腺癌生长、侵袭、转移的一个重要原因[6]。因此抑制其信号通路的激活，可抑制乳腺癌的生长、侵袭、转移过程。ALK5作为TGF-β/SMAD信号通路中重要的受体，阻断ALK5可有效抑制TGF-β/SMAD信号通路的激活，从而抑制乳腺癌生长、侵袭、转移[7-10]。本课题研究显性负性突变ALK5(DNALK5)受体对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖能力的影响，以及可能涉及作用的靶基因，为实现ALK5基因治疗提供实验基础。

1　材料与方法

1.1细胞株和腺病毒载体乳腺癌MDA-MB-231细胞、乳腺癌MCF7细胞、乳腺癌T47D细胞、乳腺癌ZR-75-3细胞、乳腺癌SK-BR-3细胞、乳腺癌MD-MB-453细胞、MD-MB-468细胞由中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心提供，DNALK5腺病毒、RFP腺病毒由本室构建，并保存。

1.2主要试剂DMEM高糖培养液(美国Life公司)；胎牛血清(美国Corning公司)；RNAiso plus、反转录试剂、荧光定量PCR试剂(大连宝生生物技术公司)； MTT检测试剂(美国Sigma公司)；PCR引物(南京金斯瑞物生物技术有限公司)；蛋白质提取裂解液和western blot检测试剂(上海碧云天生物技术有限公司)；ECL化学发光试剂盒(北京英格恩生物技术有限公司)；鼠抗人β-actin单克隆抗体(#3700)和兔抗人SMAD2/3(#8685)购自美国Cell Signaling公司；兔抗人p-SMAD2/3多克隆抗体(ab63399)、鼠抗人ID1单克隆抗体(ab66495)和兔抗人CyclinD1单克隆抗体(ab134175) 购自美国Abcam公司。

1.3荧光定量PCR引物的设计登录PubMed找到基因的相关序列，将基因序列输入Premier 5引物设计软件，得到相应引物，选择评分最高者，并进行BLAST 引物比对，确保引物的特异性，具体引物如下： ALK5上游引物5′-AGAGCTGTGAAGCCTTGAAGA -3′ ，下游引物5′- TGATGCCTTCCTTGTTGACTG- 3′；GAPDH上游引物5′- CAGCGACACCCACTCCTC-3′，下游引物5′-TGAGGTCCACCACCCTGT-3′；ID1上游引物5′-CTCTACGACATGAACGGCTGT-3′，下游引物5′-TGCTCACCTTGCGGTTCTG-3′；CyclinD1上游引物5′- AACACATCATCCCCAAACAC-3′，下游引物5′-TCACACTTCATCACTCTGGA -3′。

1.4细胞培养与实验分组乳腺癌MCF7细胞、乳腺癌T47D细胞、乳腺癌ZR-75-3细胞、SK-BR-3细胞、乳腺癌MDA-MB-231采用10%胎牛血清的DMEM高糖培养液于37 ℃、5%CO2培养，乳腺癌MD-MB-453细胞、MD-MB-468细胞采用10%胎牛血清的L15培养液培养，无CO2。乳腺癌MDA-MB-231细胞生长到70%～80%密度时，用胰酶(0.25%)消化、传代，继续培养,实验分为3组,空白对照组(MDA-MB-231组),实验对照组RFP腺病毒感染MDA-MB-231(RFP组)，实验组DNALK5腺病毒感染MDA-MB-231(AdDNALK5组)，其中RFP组和DNALK5组的腺病毒感染效率保持一致，感染率约为70%。

1.5荧光定量PCR检测ALK5受体在MDA-MB-231中表达用RNAiso plus提取各乳腺癌细胞系及MDA-MB-231各组细胞RNA，反转录成cDNA，并以cDNA为模板进行荧光定量PCR反应，检测各乳腺癌细胞系ALK5基因的表达。PCR扩增条件：预变性98 ℃10 s；变性98 ℃ 10 s，退火58 ℃ 30 s，共40个循环，用2-ΔΔCT表示基因的相对表达量。

1.6MTT检测细胞增殖改变1×105个/mL的细胞密度，按100 μL每孔细胞悬液接种于96孔板，每组设平行孔5个。细胞贴壁12 h后，将DNALK5腺病毒和RFP腺病毒分别感染MDA-MB-231，病毒感染8 h更换为含1%胎牛血清的DMEM培养液，病毒感染24 h后开始用MTT试剂检测各孔细胞的吸光度值，整个实验连续监测5 d,并根据吸光度值绘制其增殖曲线图。

1.7western blot检测DNALK5对TGF-β/SMAD信号通路改变MDA-MB-231接种于直径10 cm培养皿，待细胞密度达到50%～60%时，分别加入DNALK5和RFP腺病毒，8 h后换成1%胎牛血清的L15培养液，继续培养48 h，用预冷磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗两次，加入1 mL PBS于培养皿中，用细胞刮将细胞全部刮下，并收集于1.5 mL EP管中，800×g离心5 min后，倒掉上清液，加入250 μL RIPA阿联可冰上裂解细胞，30 min。 4 ℃，12 000 r/min离心15 min，转移上清液至1.5 mL EP管中，BCA法检测蛋白水平。取20 μL细胞蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(浓缩胶5%，分离胶10%)，湿转PVDF膜，5%牛血清清蛋白37 ℃封闭1 h，滴加相应一抗4 ℃孵育过夜，然后用TBST洗膜15 min×3次，滴加相应的二抗于室温孵育1 h，TBST洗膜15 min×3次，最后加入ECL显色液在GEL EQ上成像。

2　结　　果

2.1ALK5在乳腺癌细胞系中表达荧光定量PCR法检测ALK5在转移能力不同的乳腺癌细胞系中表达，发现ALK5在恶性程度最高的乳腺癌MDA-MB-231细胞中表达最高，相对表达量(2-ΔΔCT)=0.95±0.06，见图1。

2.2DNALK5对MDA-MB-231增殖改变显性负性突变的ALK5腺病毒(AdDNALK5)感染MDA-MB-231后，第3天AdDNALK5组细胞的吸光度值为0.35±0.04，明显低于RFP组(0.58±0.06)和空白对照MDA-MB-231组(0.61±0.05)，差异均有统计学意义(P<0.05)。第5天AdDNALK5组细胞的吸光度值为0.49±0.06，明显低于RFP组(0.93±0.07)和MDA-MB-231组(0.97±0.05)，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图2。

2.3DNALK5对MDA-MB-231细胞周期改变采取流式细胞术检测AdDNALK5感染MDA-MB-231 3 d后MDA-MB-231细胞周期改变。AdDNALK5组细胞周期G0期占(85±9)%，明显低于RFP组的G0期[(61±8)%]和MDA-MB-231组的G0期[(65±6)%]比例。

图1　　ALK5在不同转移能力的乳腺癌细胞中表达

图2　　DNALK5对MDA-MB-231细胞增殖的影响

2.4DNALK5对ID1、CyclinD1基因和蛋白表达改变通过荧光定量PCR和western blot检测ID1、CyclinD1 mRNA和蛋白的改变，AdDNALK5组ID1 和CyclinD1 mRNA相对于RFP组的表达量(2-ΔΔCT)分别为0.45和0.52。western blot检测AdDNALK5组ID1 和CyclinD1蛋白的改变，得到与mRNA一致的结果。见图3。

图3　DNALK5对MDA-MB-231细胞周期相关ID1和CyclinD1 mRNA和蛋白表达改变

2.5DNALK5对MDA-MB-231 TGF-β/SMAD信号通路的影响AdDNALK5感染MDA-MB-231后，可抑制TGF-β/SMAD信号通路，western blot检测其对TGF-β/SMAD信号通路的影响，发现SMAD2/3总的蛋白无改变，但AdDNALK5组SMAD2/3磷酸化蛋白表达明显低于RFP和MDA-MB-231组，见图4。

图4　DNALK5对MDA-MB-231 TGF-β/SMAD信号通路的关键蛋白SMAD2/3总蛋白和磷酸化蛋白的改变

3　讨　　论

乳腺癌作为女性常见的恶性肿瘤，一直是研究热点，尤其是三阴性乳腺癌的治疗是亟待解决的医学难题。有文献报道TGF-β/SMAD信号通路的持续激活促进乳腺癌的发生、发展[11]。如果能抑制TGF-β/SMAD信号通路的激活，将在一定程度上促进乳腺癌向良性过程转变。ALK5作为TGF-β膜结合受体，抑制ALK5的表达，将抑制TGF-β/SMAD信号通路的激活[12]。显性负性突变技术是一种基因工程技术，通过构建膜蛋白的胞外域结构，突变型的受体能够与野生型受体竞争性结合TGF-β配体，使信号不能通过TGF-β/SMAD传到核内，调节细胞基因转录和调控。因此，显性负性突变技术是肿瘤生物治疗的一种良好技术，显示其良好优势。显性负性突变技术和腺病毒感染技术能够对乳腺癌实行有效的生物治疗。

本研究系统分析ALK5在转移能力不同的乳腺癌细胞中的表达，发现ALK5在乳腺癌中普遍表达，在三阴性乳腺癌MDA-MB-231中发现DNALK5能够显著抑制MDA-MB-231的增殖，其DNALK5腺病毒感染MDA-MB-231后，第3天吸光度值(0.35±0.04)明显低于RFP组(0.58±0.06)，流式细胞术结果也显示细胞周期为G0期阻滞。进一步深入其作用机制发现DNALK5确实能抑制TGF-β/SMAD信号通路的激活，而且能下调其靶向基因ID1的表达。通过体外实验证实DNALK5阻断TGF-β/SMAD信号通路，能够在mRNA和蛋白水平抑制ID1表达，其机制主要就是通过下调磷酸化SMAD2/3表达来实现的。本研究在一定程度上找到治疗三阴性乳腺癌的基因治疗方法，但其在体内作用如何今后还将进行深入研究。