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植物青枯菌噬菌体保存方法的研究

2021-11-12刘露林志坚周挺等

植物保护 2021年4期
关键词:效价青枯病原液

刘露 林志坚 周挺等

中图分类号:S 476 文献标识码:A DOI:10.16688/j.zwbh 2020162

作物青枯病是一类典型的土传细菌性维管束病害,易发生,难防治。20世纪初,TWwort和dHerelle发现并报道了噬菌体(bacteriophage,phage),其广泛存在于自然界中。由于其具有寄生专一性、不易产生抗性等特点,被冠以细菌的天然“杀手”而备受关注,具有巨大的应用潜力。噬菌体是严格的专性活体寄生物,无完整细胞结构,具有株系间差异大等特点,导致在保存上必须采用不同的方法。Ackermann等报道,芽胞杆菌噬菌体AP50在-80℃下仅能存活6个月,而肠杆菌噬菌体PRD1保存12年效价仅降低3个数量级;王绍花2010年报道德氏乳杆菌噬菌体phiLdb在4℃下可保存6个月,于美玲2015年报道乳杆菌烈性噬菌体Lpla保存效果最好的温度是-80℃。高苗发现,青枯菌噬菌体∈RS-1原液于4℃下保存6个月后尚存较高的活性。因此,要开发利用噬菌体,首要的问题就是噬菌体的长期保存。由于不同的噬菌体形态结构各异,对不同条件的响应能力不同,以何种形式或方法保存,目前尚无明确定论。本研究以福建不同烟区分离的4株青枯菌噬菌体为对象,研究不同保存条件下噬菌体的活性变化,寻找适合噬菌体长期保存的方法。

1材料与方法

1.1供试菌株

青枯病菌Ral3tonia pseudosolanacearum Z5;青枯病菌短尾噬菌体Pl,P2,P3和P4均由本实验室分离、鉴定保存。

1.2青枯病菌培养

将保存于-75℃的青枯病菌Z5活化后挑取单菌落于装有100 mL NB培养基(蛋白胨5g/L、牛肉浸膏3 g/L、葡萄糖2.5 g/L,pH 7.2)的三角烧瓶中,28℃,180r/min振荡培养至浓度约1×108cfu/mL,备用。

1.3噬菌体培养

按1%( V/V)的接种量将噬菌体原液接种于1.2培养的青枯病菌悬浮液中,摇匀,静置15 min,28℃,130r/min振荡培养12~16h,获得噬菌体培养液,12000r/min离心5 min后经0.45μm滤膜抽真空过滤除菌,上清液为噬菌体原液,效价为2×1010PFU/mL,备用。

1.4噬菌体保存方法

设4个处理,处理1:噬菌体原液;处理2:噬菌体原液:青枯菌液=1:1(V/V,下同);处理3:噬菌体原液:青枯菌液:40%甘油=1:1:2(1mL噬菌体原液和1mL青枯菌液以及2mL 40%甘油的混合液);处理4:噬菌体原液:青枯菌液:80%甘油=1:1:2(1mL噬菌体原液和1mL青枯菌液以及2mL80%甘油的混合液)。分别置于-75、-25、4℃和室温保存,90、180、270 d和365 d分别取样,测定噬菌体的效价。

1.5噬菌体的效价测定

噬菌体效价(plaque-forming unit,PFU):是指每毫升样品中所含有的具有侵染性的噬菌体粒子数,采用双层平板法测定,具体测定方法参照高苗的方法。

噬菌体效价(PFU/mL)=平均噬菌斑数×2×稀释倍数。

2结果与分析

4种不同处理的噬菌体分别在-75、-25、4℃、室温下保存的结果见表1~表4。结果表明,-75℃和-25℃下保存(表1、表2),4种处理的保存效果都较好,365d后效价下降0~3个数量级,其中噬菌体P4株系的保存效果最好,其次为噬菌体P1和P2株系,噬菌体P3株系较差,如保存365 d后噬菌体P4株系效价只下降0~1个数量级,噬菌体P3株系效价却下降1~3个数量级;4℃下保存(表3),噬菌体原液处理和噬菌体原液:青枯菌液=1:1处理的保存效果最好,365 d后效价下降1~5个数量级,其中噬菌体P4株系效价只下降1个数量级,噬菌体原液:青枯菌液:40%甘油=1:1:2处理的保存效果次之,365 d后效价下降5~7个数量级,噬菌体原液:青枯菌液:80%甘油=1:1:2处理的保存效果最差,90 d后效价下降6~7个数量级;室温保存的效果总体较差(表4),但其中噬菌体原液:青枯菌液=1:1处理的保存效果相对较好,180 d后效价下降1~2个数量级,270 d后效价下降6~7个数量级;其次为噬菌体原液处理,噬菌体Pl和P2株系保存90 d后全部失活,而噬菌体P3和P4株系保存180 d后,其效价下降6个数量级;噬菌体原液:青枯菌液:40%甘油或80%甘油=1:1:2处理的保存90 d后,噬菌体P1、P3和P4株系全部失活,但噬菌体P2株系采用噬菌体原液:青枯菌液:40%甘油=1:1:2处理,保存365 d仍有较高的活性,效价仅仅下降3个数量级。

3讨论

噬菌体的保存方法已有报道,主要集中在对动物病原细菌噬菌体的保存,常见的有噬菌体原液或噬菌体原液加入甘油、DMSO等保护剂,于室温、4℃、冻干、-75'C或液氮保存,但噬菌体不同,效果也不同。如李陇平等报道金黄色葡萄球菌烈性噬菌体加入7% DMSO,-80℃冷藏3个月,效价与初始效价保持同一个指数级;黎尔纳等报道3株木糖氧化无色杆菌噬菌体原液加入甘油或DMSO后,于-80℃、-20℃和4℃保存16个月后,其中2株的效价能稳定在初始状态,1株的效价降低1个数量级。本研究结果与前人的研究结果相似,供试的4株噬菌体同法同温保存,但效果不同,如采用噬菌体原液:青枯菌液:80%甘油=1:1:2方法-75℃保存365 d,噬菌体P3株系的效价下降2个数量级,而噬菌体P1、P2和P4株系的效价稳定在初始状态;采用噬菌体原液室温保存,90 d后噬菌体Pl和P2株系全部失活,270 d后噬菌体P3株系全部失活,而噬菌体P4株系仍有活性。

Golec等报道,-80℃下有尾噬菌体储存于宿主体内,不会影响噬菌体和宿主的生存能力;高苗报道噬菌体原液+20%甘油室温和4℃保存6个月后均检测不到噬菌斑。本研究结果显示,室温和4℃下添加宿主可提升保存效果,添加甘油反而不利;低温下(-75℃和-25℃)添加宿主对噬菌体的保存效果影响不大,但添加甘油可提升保存效果。室温下,噬菌体原液:青枯菌液=1:1保存180 d,效价下降1~2个数量级,而噬菌体原液保存的效价下降了6个数量级或全部失活;另外,添加甘油处理的噬菌体90 d后全部失活(噬菌体P2株系除外);-75℃和-25℃下,添加甘油处理的保存365d,噬菌体效价降幅最大的仅2个数量级。由于噬菌体是一种寄生于活体细胞内的非细胞生物,一旦离开寄主就不能独立新陈代谢,但低温可降低其新陈代谢,保持活性,因此低温可提高噬菌体的保存效果;室温下,由于噬菌体的代谢活动正常,需要充足的宿主,因此添加宿主有利于噬菌体保持活性,若添加甘油,宿主受甘油保护,噬菌体的侵染几率下降或完全不能侵入,导致效价下降。

综上所述,噬菌体原液:青枯菌液=1:1处理在4种温度下保存都能保持较高的活性,尤其是室温保存180 d后,噬菌体效价仅下降1~2个数量级,保存270 d后噬菌体仍有较高的活性。该方法不需要添加保护剂,不受试验条件限制,可为今后噬菌体制剂的生产及应用提供参考依据,是青枯菌噬菌体最简单易行的保存方法。另外,无论何种处理,-75℃和-25℃的保存效果都表現最好,可长期保存噬菌体。

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