麦麦提依明·托合提　文国道　唐超　李俊漾　胡跃兵　马驰原*

(1新疆维吾尔自治区人民医院神经外科，新疆 乌鲁木齐 830001; 2南京大学医学院附属金陵医院神经外科, 江苏 南京 210002)

垂体腺瘤(pituitary adenomas, PAs)是最常见的颅脑肿瘤之一，约占全部颅脑肿瘤的10%[1]。绝大多数垂体瘤被认为是良性肿瘤，然而部分肿瘤可以侵袭邻近结构如蝶窦、海绵窦，甚至是脑组织，不但引起相应的临床表现，更使垂体腺瘤的外科治疗加倍困难，故垂体腺瘤的早期诊治极其重要。本部分实验主要研究人类前提度蛋白2(anterior gradient 2, AGR2)在垂体腺瘤组织中的表达和分布；评价AGR2与垂体腺瘤侵袭性的关系。

材料与方法

一、病例资料的收集

收集2013年5月至2014年7月在我院神经外科经手术切除的垂体腺瘤新鲜标本。所有标本均经过本院病理科确诊为垂体腺瘤。标本分成两份，一份浸泡在4%多聚甲醛中，另一份经生理盐水冲洗后立即放入-80 ℃超低温冰箱保存。

肿瘤标本入选标准：①病理确诊为垂体腺瘤者；②发病后随访时间超过两年者；③影像学能明确侵袭性或非侵袭性者；④单一分泌类型的垂体腺瘤者。肿瘤标本排除标准：①垂体腺瘤卒中或者囊变者；②发病后随访时间低于两年者；③影像学不能明确侵袭性或非侵袭性者；④诊断为混合型垂体腺瘤者；⑤标本较小无法进行检测者。

所收集垂体腺瘤组织标本共117例。其中无功能性(non-functioning, NF)腺瘤组织56例，生长激素(growth hormone, GH)腺瘤组织24例，泌乳素(prolactin, PRL)腺瘤组织24例，促性腺激素(follicle stimulating hormone, FSH)腺瘤组织8例，促肾上腺皮质激(adenocorticotropic hormone, ACTH)腺瘤组织5例。根据垂体腺瘤Hardy分类法和Knosp分类法将垂体腺瘤分为侵袭性垂体腺瘤和非侵袭性垂体腺瘤[2]。其中侵袭性垂体腺瘤70例，非侵袭性垂体腺瘤47例。

二、方法与试剂

1.免疫组化染色：将新鲜肿瘤组织常规石蜡包埋后用切片机连续切片，厚度为5 μm，并按免疫组织化学染色步骤对其进行染色，免疫组化用常规的SABC法，抗AGR2抗体(稀释比例为1/400)来自美国CST公司。染色强度分为0(阴性)，1(弱阳性)，2(中度阳性)，3(强阳性)。根据阳性范围占整个切片的百分比将染色范围分为0(0%)，1(1%～25%)，2(26%～50%)，3(51%～75%)，4(76%～100%)。每张切片染色强度的分值加染色范围的分值为该张切片的总分(0～7分)。总分大于2分被认为是阳性，其中2～3分为低表达，大于3分为高表达。

2.免疫荧光染色：将新鲜组织常规石蜡包埋后用切片机连续切片，厚度为5 μm，并按免疫荧光染色步骤对其进行染色，其中抗AGR2抗体(稀释比例为1/400)来自美国CST公司。最后用荧光显微镜镜检拍照并采集图像。

3.免疫印迹试验(Western blot)检测法：将按照Western blot分离胶和浓缩胶的配置方案(上海碧云天)配置分离胶和浓缩胶，其中分离胶浓度为12%，浓缩胶的浓度为5%，将按照蛋白提取试剂盒(上海碧云天)说明书提取的蛋白放入加样孔并按说明书依次完成相关步骤，最后采用Image J图像分析软件分析条带上目标分子的平均灰度值。

三、统计学分析

采用SPSS 18.0软件进行统计学分析。用卡方检验比较AGR2在侵袭与非侵袭性垂体腺瘤的表达差异。AGR2表达与临床参数的关系使用卡方检验或Fisher精确检验法。P<0.05时认为差异有统计学意义。

图1垂体腺瘤组织免疫组化染色(×200)

Fig 1Expression of AGR2 in PAs(×200)

A: High expression of AGR2 (++); B: Low expression of AGR2 (+); C: AGR2 negative. AGR2 was mainly located in the membrane and cytoplasm. The results showed that AGR2 expression could be highly expressed in the non-invasive PAs (A) and it was hardly observed in the invasive PAs (C).

Bar=10 μm.

结　　果

一、AGR2在垂体腺瘤组织中的表达

垂体腺瘤组织AGR2免疫组化染色结果如图1所示。在117例组织标本中，共60例组织标本AGR2表达阳性，阳性率为51.3%。不同分泌类型的垂体腺瘤中ACTH腺瘤阳性率最高，为80.0%(4例)，其次分别为FSH腺瘤(75.0% 6例)、GH腺瘤(62.5% 15例)、NF腺瘤(44.6% 25例)，阳性率最低为PRL腺瘤(41.7% 10例)。AGR2在垂体腺瘤不同分泌类型中的表达无显著统计学差异(χ2=6.537,P=0.162>0.05)。

图2显示对垂体腺瘤不同亚型的Western blot结果。在垂体腺瘤不同亚型中AGR2蛋白表达阳性率无显著差异，在不同分泌类型的垂体腺瘤组织中均有不同水平AGR2蛋白表达。

二、AGR2在垂体腺瘤组织细胞中的分布

图3显示垂体腺瘤免疫荧光染色结果。结果提示：在垂体腺瘤组织AGR2免疫荧光染色中，AGR2(绿色)与4', 6-二脒基-2-苯基吲哚(4', 6-diamidino- 2-phenylindole DAPI)(蓝色)几乎无重叠，表明在垂体腺瘤细胞中，AGR2蛋白定位胞浆和胞膜中，与免疫组化染色结果相一致。

图2垂体腺瘤组织不同亚型的AGR2的表达

Fig 2The expression of AGR2 in different PAs subtypes detected by Western blot

PRL: Prolactin-secreting PAs; GH: Growth hormone secreting PAs; ACTH: Adenocorticotropic hormone secreting PAs; FSH: Follicle stimulating hormone secreting PAs; NF: Non-functioning PAs.

β-actin was served as loading control. S1 represents Sample 1 and S2 represents Sample 2.

三、垂体腺瘤中AGR2的表达与其临床特征的关系

垂体腺瘤组织中AGR2的表达与各临床因素的关系如表1所示。结果所示，垂体腺瘤中AGR2的表达水平高低仅与肿瘤的侵袭性有显著相关(P<0.001)，与患者性别、年龄、肿瘤是否复发及肿瘤的大小无显著相关(P>0.05)，在大多数侵袭性垂体腺瘤组织中AGR2表达阴性，而在大多数非侵袭性垂体腺瘤组织中AGR2表达阳性。垂体腺瘤中AGR2的表达水平高低与。对垂体腺瘤组织的Western blot结果也验证了这一结果(图4)。

表1垂体腺瘤患者临床病例特征与AGR2表达的关系 [n(%)]

Tab 1Association between AGR2 expression and clinical pathological characteristics from patients with PAs [n(%)]

ParameternAGR2-+ Cases11757(48.7)60(51.3) Male65(55.5)32(27.4)33(28.1) Female52(44.5)25(21.4)27(23.1) Age (years) ≤5067(57.3)30(25.6)37(31.7) >5050(42.7)27(23.1)23(19.6) Invasive Yes70(59.8)46(39.3)24(20.5)a No47(40.2)11(9.4)36(30.8) Recurrence Yes12(10.3)7(6.0)5(4.3) No105(89.7)50(42.7)55(47.0) Tumor size ≤10 mm13(11.1)4(3.4)9(7.7) >10 mm104(88.9)53(45.3)51(43.6)

aP<0.001,vsnon-invasive PAs group.

图3垂体腺瘤组织免疫荧光染色(×400)

Fig 3Immunohistofluorescence staining for expression and distribution of AGR2 in PAs (×400)

A1, B1：Immunohistofluorescent staining of AGR2 (green); A2, B2: The counterstained images of nucleus with DAPI (blue); A3, B3: The merged images of AGR2 (green) and DAPI (blue).

AGR2 was mainly located in the membrane and cytoplasm. The number of AGR2-positive cells was expressed as percentage of total cells. It showed that AGR2 expression could be highly expressed in the non-invasive PAs (A1～A3), and it was hardly observed in the invasive PAs (B1～B3).

Bar=20 μm.

图4垂体腺瘤组织AGR2的表达与肿瘤侵袭性的关系

Fig 4The expression of AGR2 in invasive or non-invasive PAs

讨　　论

垂体腺瘤以其肿瘤生物学特性可分为非侵袭性垂体腺瘤、侵袭性垂体腺瘤以及垂体腺癌。其中，非侵袭性微腺瘤由于肿瘤体积小、缺乏特异性临床表现，早期难以发现。侵袭性垂体腺瘤约占垂体腺瘤30%～55%，它具有高增殖活性、高侵袭能力、术后易复发、临床治愈率低等特点[3]。侵袭性垂体腺瘤被发现时肿瘤体积多已巨大，并常侵犯海绵窦等多个肿瘤周围重要结构，因此外科手术切除率和病情缓解率远低于非侵袭性垂体腺瘤[4]。因此，垂体腺瘤的早发现、早诊断、早治疗至关重要。

AGR2是源于非洲爪蟾蛋白XAG2(Xenopus anterior gradient 2)的人型同系物，它在爪蟾胚胎的生理发育生长过程中发挥了重要的作用[5]。目前，关于AGR2在对人体的生理作用尚不清楚。AGR2 主要和激素依赖性肿瘤相关，例如乳腺癌、胰腺癌、肺癌、前列腺癌等。AGR2 在一些肿瘤中表现出了明显的致癌基因的相关特征，例如促进细胞增殖，促进肿瘤耐药等，它还能促进肿瘤细胞的迁移[6-8]。然而，在肝癌、结直肠癌以及鼻咽癌中，AGR2 表达下降被认为与患者较差的预后有密切的关系[9-11]。所以AGR2 在不同的肿瘤中的表达有很大的差异，其在不同肿瘤发生发展的过程中的作用也有很大的差异。

文献报道，AGR2的表达缺失在肠息肉患者肠组织异常增生到癌变进展过程中起重要作用[10]。Riener等发现AGR2在结肠癌细胞系以及结肠癌组织标本中的低表达可能与肿瘤低分化及转移密切相关[11]。亦有人认为AGR2可能是原发性结直肠癌预后判断的独立指标之一。在本研结果表明，在117例不同分泌类型的垂体腺瘤组织中，AGR2阳性率仅为51.3%。虽然不同分泌类型垂体腺瘤组织中AGR2的表达略有不同，其表达率从高到低分别为ACTH腺瘤(80.0%)，FSH腺瘤(75.0%)，GH腺瘤(62.5%)，NF腺瘤(44.6%)以及PRL腺瘤(41.7%)，AGR2在不同分泌类型的垂体腺瘤组织中的表达在统计学上无显著差异(P>0.05)。我们还分析了垂体腺瘤相关临床特征与肿瘤组织中AGR2表达水平的关系，结果表明肿瘤侵袭性与AGR2的表达水平显著相关(P<0.001)。在大多数侵袭性垂体腺瘤组织中AGR2表达阴性，而在大多数非侵袭性垂体腺瘤组织中AGR2的表达阳性，这与Riener等人的实验结果一致的。关于AGR2在垂体腺瘤组织致侵袭性或者癌变中的作用机制可能需要更多的体外和体内实验来揭示。

本研究中，我们检测了117例垂体腺瘤组织标中AGR2蛋白表达水平。结果表明，AGR2在非侵袭性垂体腺瘤组织中的表达水平显著高于侵袭性者。AGR2不仅能作为研究垂体腺瘤侵袭性的靶标，还能作为垂体腺瘤诊断和预后评价的潜在生物学标志物。