王丽娜 吴翠松 陈薇薇

（江苏大学附属镇江三院艾滋病科，江苏 镇江 212005）

艾滋病（AIDS）是一种获得性免疫缺陷综合征，因较高传染性和不可治愈性引起极高的关注。艾滋病患者会出现的各种严重并发症及肿瘤，预后极差，使其成为严重威胁我国人民的公共卫生问题。目前已经影响到了国民经济发展和全社会稳定[1]。本实验采用实时荧光PCR（real-time fluorescener）方法将艾滋病患者与正常对照者粪便中的五种细菌进行定量检测，与正常对照组进行比较，分析肠道菌群变化的差异，为临床诊疗进行治疗提供一定的理论依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

1.1.1 观察组：2010年1月至2016 年1月镇江市第三人民医院诊治的急性感染期、无症状期、艾滋病期患者大便标本各10份，共30例，男性22例，女性8例，年龄19～56岁，平均年龄 （36.05±8.93）岁，粪便采样前4周内未使用抗生素或微生态制剂；其C淋巴细胞数在（0～676）×106/L，并且无慢性腹泻症状。

1.1.2 对照组：正常对照组30例，男性例22，女性8例，年龄18～54岁，平均年龄 （33.13±8.73）岁。来源于观察组的配偶或工友共30例。均无胃肠道疾病史，留取粪便标本前4周内未使用微生态制剂或/和抗菌药物。

1.2 研究材料

1.2.1 引物设计根据细菌的ddl基因序列设计粪肠球菌及屎肠球菌的特异性引物；根据细菌的16SrRNA基因序列设计双歧杆菌属、乳酸杆菌属和大肠杆菌的特异性引物。

1.2.2 实验试剂细菌基因组DNA提取试剂盒、荧光染料等。

1.2.3 主要仪器 PCR扩增仪、电泳仪等。

1.3 方法：留取自然排便的新鲜粪便，取回实验室，用天平秤取每份100 mg，按实验要求处理后，按细菌基因组DNA提取试剂盒提供的说明提取正常对照组及艾滋病患者的粪便细菌DNA[2]。

1.3.1 依据正常对照者粪便基因组DNA来制作五种菌群的标准曲线，应用PCR方法对细菌引物进行特异性扩增，将得到的扩增产物按DNA纯化试剂盒说明进行纯化，测定纯化产物A值及浓度，依据实验结果制作标准曲线。

1.3.2 将待测粪便样品中提取的DNA分别进行5种细菌的实时荧光定量PCR检测，根据反应溶解曲线分析产物的特异性，并对结果进行定量分析。

1.4 统计学方法：实验数据采用SPSS17.0统计学软件进行分析，两组间一致性检验用t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 用扩增曲线来表示不同拷贝数的模板循环数与荧光强度关系，二者关系呈S形，分为基数期、对数期及平台期3个阶段。其中对数期是荧光信号指数扩增阶段，细菌的定量分析在这个阶段进行。

2.2 以对数转换后的拷贝数为横坐标，以循环数为纵坐标，绘制标准曲线，作为待测样品的定量检测的参照标准。

2.3 通过溶解曲线反向验证引物的特异性，以上5种细菌的溶解曲线均为单峰，说明扩增产物单一。

2.4 粪便细菌定量检测结果：AIDS/HIV患者粪便中的双歧杆菌属及乳酸杆菌属数量显著少于正常对照组，P＜0.05；而粪肠球菌、大肠杆菌和屎肠球菌的数量则显著高于正常对照组，P＜0.05。见表1。

3 讨 论

肠道是人体内细菌密度最大的部位，肠道内正常菌群之间互相依赖、制约形成肠道微环境，是人体最重要的微环境。人体绝大部分的淋巴组织及细胞定位于肠道组织内。约40%的总T细胞位于肠黏膜上皮内。因此肠道成为HIV感染早期病毒复制的靶点[3]，也是CD4

+T细胞遭受破坏的主要部位。故消化道是HIV感染过程中最常发生并发症的系统之一。双歧杆菌是专性厌氧菌，占肠道总菌量的99%，具有免疫调节也营养的作用，大肠杆菌、粪肠球菌等兼性厌氧菌占肠道菌群的百分之一，在正常生理状态下不致病。一旦平衡遭到破坏，微生态失调即可造成感染[4]。几乎所有AIDS/HIV患者都存在不同程度的免疫缺陷；病毒攻击肠道中的T细胞，肠壁屏障功能受损，肠道敏感菌被抑制，而未被抑制的条件制致病菌如粪球菌、大肠杆菌等大量繁殖，引起菌群失调；释放的内毒素移位，促进肠源性感染的发生与发展[5]，引发全身多器官功能衰竭。本实验通对AIDS/HIV患者肠道内五种细菌的定量，与正常对照组进行比较，结果显示AIDS/HIV患者粪便中双歧杆菌属、乳酸杆菌属数量显著下降，而大肠杆菌、粪肠球菌及屎肠球菌数量明显增多。从而说明AIDS/HIV患者肠黏膜屏障受到攻击破坏后，肠道内的双歧杆菌、乳酸菌急剧减少；大肠杆菌、粪肠球菌和屎肠球菌得以大量繁殖，发生细菌移位，导致全身感染，最终不可控制，出现多器官衰竭，同时还有可能导致其他疾病的发生，如卡波西肉瘤、恶性淋巴瘤、子宫颈癌[6]。随着对AIDS/HIV患者肠道微生态研究的不断深入，目前已取得了一定的进展，为临床预防及诊治提供了可靠地参考。

表1 粪便标本细菌定量检测结果（-x±s，n=30）

[1] 中华医学会感染病学分会艾滋病组.艾滋病诊疗指南[J].中华传染病杂志,2011,29(10)：629-640.

[2] 郭世奎,王昆华,龚昆梅,等.结直肠癌患者粪便DNA提取方法的比较[J].云南医药,2009,30(5)：520-523.

[3] 张琳萄,夏雪山,郑永唐.艾滋病猕猴模型的肠道病理学研究进展[J].免疫学杂志,2015,28(3)：265-276.

[4] 吴建军,曾清,温广德.双歧杆菌四联活菌治疗慢性溃疡性结肠炎的临床疗效观察[J].现代消化及介入诊疗,2010,15(2)：116-117.

[5] Magnotti LJ,Deiteh EA.Burns,bacterial translocation,gutbarrier function,and failure [J].Bum Care Rehabil,2005,26(5)：383-391.

[6] KOIKE M,Masuda A,Ichikawa K,et al.Plasmablastic lasmablastic lymphoma of the duodenal and jejunum[J].Int J Clin Exp Pathol,2014,7(7)：4479-4483.