何军兰，王永斌，贾忠，同重湘，韩建军

（兰州市肺科医院呼吸内科，甘肃 兰州 730046）

结核病是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起的传染性疾病[1]。机体在抵抗MTB的免疫过程中，T细胞介导的细胞免疫发挥主要作用。T细胞亚群根据功能不同可分为调节性T细胞（Regulatory T cells，Tregs）、辅助性T细胞细胞、细胞毒性T细胞等，其中Tregs在MTB慢性感染及发病过程中发挥重要作用[2-3]。本文旨在通过对健康人群与结核患者特异性免疫指标的变化对比。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2017年3月始兰州市肺科医院患者150例。根据下列纳入标准分为5组：①对照组：T-SPOT试验阴性的未感染MTB的健康人或患者，排除患有结核，无明显结核暴露史。②MTB潜伏感染者：T-SPOT试验阳性的无临床症状的MTB感染者。③未治疗的活动性肺结核患者：根据临床症状、胸片或痰涂阳性确定为肺结核者，尚未进行抗结核治疗。④抗结核治疗3个月的活动性结核患者：持续抗结核治疗3个月的活动性肺结核患者。⑤治愈的结核患者：活动性肺结核经抗结核治疗后临床痊愈者。均为30例。

1.2 方法

1.2.1 靶标选择

Tregs群中，CD4+T细胞和CD8+T细胞对机体抵抗MTB感染中发挥了主要的免疫应答作用。Tregs分泌的肿瘤生长因子TGF-β可缓冲炎症反应，保护机体组织[4]。

1.2.2 试验方法

1.2.2.1 不同疾病阶段Treg表型变化

采集外周血1 0 m L，计数、洗涤方法同上，用RPMI1640培养基调整细胞浓度至所需浓度。将单个核细胞接种于96孔板，每孔5×106个细胞，加入2.5 µg/ml的抗原ESAT-6刺激48h，利用流式细胞术（Flow cytometry，FCM）检测CD4、CD25、Foxp3、CTLA-4和GITR等分子[5]。

1.2.2.2 不同疾病阶段Treg抑制效应T细胞的能力

采集外周血10 mL，计数、洗涤方法同上，用结核抗原ESAT-6刺激的同时加入达利珠单抗注射液（抗人CD25抗体）以抑制Tregs，培养后对细胞表面分子（CD4、CD8）的染色，经过固定、透膜后再染细胞内的FoxP3分子，染色后样品以FACS calibur流式 细胞仪检测；收集细胞培养上清，应用ELISA测定反映Treg功能的细胞因子TGF-β、IL-10和反映效应T细胞功能的免疫分子IFN-γ、TGF-β、IL-2、TNF-α、穿孔素。

2 结 果

2.1 调节性T细胞及FoxP3检测

感染MTB的患者（无论是否治愈），CD4+T细胞明显多于CD8+T细胞（P ＜ 0.05）。FoxP3+与CD4+T细胞阳性率无显著性差异（P＞0.05），与转录因子FoxP3主要表达于自然调节性CD4+T细胞说法相符合。流式细胞检测结果组间阳性率比较为：健康组＜未治疗活动性结核组＜治疗中活动性结核组＜潜伏感染组＜治愈组。如表1。

表1 流式细胞检测阳性率 [n（%）]

2.2 ELISA靶标检测

利用ELISA测定各组别中试验对象的血清中工IL-2、IFN-γ、TGF-β和穿孔素的水平。如表2。

表2 ELISA测定各靶标平均值（±s，ng/mL）

表2 ELISA测定各靶标平均值（±s，ng/mL）

组别IL-2IFN-γTGF-β穿孔素健康对照组35.99±20.6258.76±33.5284.22±13.07 0.08±0.03潜伏感染组66.20±17.2645.57±15.84103.75±14.33 0.14±0.35未治疗活动性结核组82.45±29.4552.66±4.48102.41±27.13 0.15±0.27治疗中活动性结核组100.01±38.97 59.96±22.44113.74±15.61 0.13±0.07治愈组52.29±21.5654.00±13.2885.75±26.50 0.09±0.14 P ＜ 0.05＞0.05 ＜ 0.05 ＜ 0.05

3 讨 论

Tregs在MTB感染过程中发挥重大免疫作用，但同时MTB也可减弱CD4+T细胞和CD8+T细胞免疫应答的能力，可通过抑制细胞凋亡延迟Tregs应答以及降低Tregs释放免疫因子的能力。这两点在本实验中也得到了证实，表现在流式细胞检测阳性率结果中活动期阳性率低于潜伏期，以及ELISA测定结果值中各指标相对值的变化。此外，本试验通过对不同组别免疫指标对比，可归纳出MTB感染者不同疾病阶段或病理状态下Tregs功能的变化，从而为临床判断结核病情处于发展、转归、治愈何种阶段提供指导意义，进而给予相应免疫治疗的干预；同时试验也可为今后结核感染免疫制剂的研发提供参考价值。

[1] 买月琴.结核患者DC亚群的变化和结核杆菌抗原对DC成熟及调节γδT细胞功能的影响[D].蚌埠医学院,2012.

[2] 董 毅,吴利先.T细胞免疫在抗结核杆菌感染中的研究进展[J].现代生物医学进展,2014,14(18):3593-3595.

[3] 焦志军,尤海燕,陈 蕾,等.流式细胞术检测表达FoxP3的CD4+CD25+调节性T细胞[J].临床检验杂志,2008,(3):161-163.