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内蒙古奇乾地区媒介蜱携带伯氏疏螺旋体的调查研究

2018-03-21蒋兰芬浮飞翔

传染病信息 2018年1期
关键词:疫源地螺旋体基因型

汤 芳,周 磊,蒋兰芬, 栾 进,浮飞翔

莱姆病(Lyme disease, LD)是由伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferii, B.b)侵犯机体而引起的全身性多系统疾病,该病是经媒介蜱传播的一种自然疫源性疾病。LD分布相当广泛,我国自1986年首次在黑龙江省海林县林区发现该病以来,大小兴安岭、天山、长白山、燕山、阿尔泰山等林区均存在人群感染[1]。内蒙古奇乾地区地处中俄界河额尔古纳河畔,大兴安岭北部原始森林腹地,北纬 52°11′45.30″ ,东经120°46′21.42″,为高寒山林和寒温带大陆性气候,年平均气温-6 ℃,年平均降雨量436.5 mm。该地区自然资源丰富,媒介物种多样,生态环境适宜LD的发生流行。为进一步了解奇乾地区媒介蜱中B.b感染及基因分型情况,本研究对该地区进行了选点调查研究。

1 材料与方法

1.1 标本采集 在媒介蜱活动高峰期(4—6月),根据奇乾地区自然地理和生态环境的特点,选择有代表性的生境(山地森林景观和灌丛草地景观)作为调查点,用布旗法采集游离蜱,媒介蜱经分类鉴定后使其保持存活状态,待送往实验室进行病原学的检测。

1.2 实验室检测

1.2.1 标本处理及模板制备 将采集到的媒介蜱标本放入用75%乙醇浸泡10 min,高压灭菌滤纸吸干媒介蜱体表乙醇,0.9%氯化钠溶液漂洗3次后,将单只媒介蜱置于1.5 ml离心管中,加入DNA提取缓冲液50 μl,用组织研磨器将蜱捣碎、研磨,沸水中煮10 min,置-20 ℃保存备用。

1.2.2 PCR扩增 根据文献设计特异性引物[2-3],用PE9700 PCR扩增仪(美国ABI公司)进行PCR 扩增。PCR 反应体系由 10×PCR buffer 2.5 μl,dNTP MIX 2 μl,Taq 酶 0.3 μl,上下引物各 l μl组成,充分混匀后加入DNA模板1 μl;扩增条件 94 ℃ 5 min→94 ℃ 30 s ,41 ℃ 30 s,72 ℃1 min→72 ℃10 min,扩增36个循环。取PCR产物5 μl,用1.2% 的琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,凝胶成像分析系统(法国Vilber Lourmat公司)观察结果。每次实验都设立空白(水)对照,并采取严格措施以避免污染。

1.3 DNA同源性比较和聚类分析 PCR扩增产物送北京天一辉远生物公司测序,通过Internet进入美国国家生物技术信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov)站点后,把测序所获得序列与GenBank中已注册的基因序列进行BLAST比对。

1.4 统计学处理 数据录入、分析采用SPSS 13.0软件,计算相应频数和阳性率。

2 结 果

2.1 媒介蜱采集情况 共采集游离蜱320只,其中全沟硬蜱293只(91.56%),嗜群血蜱5只(1.56%),森林革蜱22只(6.88%)。

2.2 媒介蜱感染情况 奇乾地区媒介蜱B.b感染阳性携带86只,阳性率为26.88%。其中全沟硬蜱B.b阳性携带率为29.01%(85/293);森林革蜱B.b阳性携带率4.55%(1/22);嗜群血蜱未检测出B.b(详见表1)。媒介蜱携带B.b有3种基因型:B.garinii、B.afzelii和B.miyamotoi,其中B.garinii阳性携带率为18.13%(58/320),B.afzelii阳性携带率为6.25%(20/320),B.miyamotoi阳性携带率为2.50%(8/320)。

表1 奇乾地区媒介蜱B.b感染情况[例(%)]Table 1 Prevalence of B.b in ticks among Qiqian region[cases(%)]

2.3 序列分析 将PCR阳性产物进行测序、序列比对和聚类分析发现,B.b阳性序列为B.garinii、B.afzelii和B.miyamotoi基因型。

3 讨 论

本研究共采集媒介蜱320只,其中全沟硬蜱293只(91.56%),嗜群血蜱5只(1.56%),森林革蜱22只(6.88%),表明内蒙古奇乾地区媒介蜱以全沟硬蜱为优势蜱种。媒介蜱B.b阳性携带率为26.88%,其中全沟硬蜱B.b阳性携带率为29.01%,森林革蜱B.b阳性携带率4.55%,嗜群血蜱均未检测出B.b,提示全沟硬蜱是该地区LD的主要传播媒介。媒介蜱携带B.b有3种基因型:B.garinii、B.afzelii和B.miyamotoii,结果提示该地区B.b基因型存在多样性的特点。其中B.garinii阳性携带率最高,为18.13%(58/320),B.afzelii、B.miyamotoi阳性携带率分别为6.25%(20/320)和2.50%(8/320)。B.garinii是B.b最常见的基因型别,许多国家、地区的宿主动物和媒介蜱体内都可以检测到该基因型的存在[4-12]。研究发现内蒙古大兴安岭林区媒介蜱及鼠体内存在B.b的感染,以全沟硬蜱的感染率最高,以B.garinii为主要基因型[13]。B.afzelii是B.b第二种常见的基因型别,分布范围和B.garinii类似,在啮齿动物和媒介蜱中也有类似的分布[14]。B.miyamotoi属于疏螺旋体属中的回归热螺旋体,但生物学上与B.b中的B.garinii、B.afzelii和B.burgdorferi等更为接近。主要寄生在硬蜱体内,常与B.garinii、B.afzelii等基因型混合感染,目前尚未发现有B.miyamotoi单独感染的报道[15-16]。

内蒙古地区是我国蜱媒传染病的重要疫区之一,在宿主动物和媒介蜱中发现携带有包括B.b、斑点热群立克次体、嗜吞噬细胞无形体、查菲埃立克体、森林脑炎病毒等多种病原体感染。奇乾地区自然景观复杂多样、生态物种丰富,为LD自然疫源地的形成和持续存在提供了必要条件。因此,下一步研究我们还须要从传播媒介、宿主动物和易感人群3个流行环节开展自然疫源地流行病学调查,确定自然疫源地性质与特征,掌握疫源地演变规律,获得系统的流行病学本底资料。

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