徐嘉威， 梁君桐， 黄殷琦， 熊业城， 张子敬, 王二耀, 雷初朝， 陈 宏， 黄永震*

(1.西北农林科技大学动物科技学院,陕西 杨凌 712100;2.西安交通大学医学部基础医学院生物化学与分子生物学系，西安 710061；3.河南省农业科学院畜牧兽医研究所，郑州 450002)

KLF3又被称之为碱性KLF因子(Basic Kruppel-like factor, BKLF)，同其他KLF因子一样拥有锌指结构基团、核定位信号以及富含氨基酸的功能区。KLF家族因子含有锌指结构域，可以结合DNA中的GC-box或相关的CACCC元件的一类基本转录蛋白，其依靠对于有特定GC-box启动子的基因转录调控，通过与辅助抑制因子羧基端结合蛋白(C-terminal binding protein，CtBP)相关联来抑制基因表达[1]。KLFs在细胞周期、肿瘤侵袭等重要生物学进程中发挥作用。KLF3基因在各个组织广泛表达，而在牛的组织中位于肝脏、肺脏的表达量较高。通过蛋白功能预测分析，结果显示KLF3在复制与转录、调节功能以及辅因子的生物合成过程中发挥作用和作为转录因子、转录调控因子以及信号转导分子发挥作用的可能性较大[2]。对KLF3的生物学特性如对脂肪生成、肌肉基因调控等的深入研究，可为该基因遗传标记奠定基础，从而对研究影响动物生长发育及调控提供了媒介，为今后动物育种提供新思路。

1 KLF3基因蛋白的分子结构

KLF3基因在人体内位于4号染色体4p14，拥有8个外显子，基因全长为37 459 bp。牛的KLF3基因位于6号染色体上，有7个外显子，其基因全长为27 143 bp，编码346个氨基酸。猪的KLF3基因定位于8p21.2，拥有8个外显子，编码347个氨基酸，与人的KLF3蛋白有高度的同源性[3]。KLF3转录因子同其他KLF家族中的因子一样在C端通过Cys2-His2锌指结构域与目的序列结合，并且都有3个并列排列的锌指结构域。其中，每个结构域中的Zn2+与2个Cys和His在空间上相互作用形成稳定结构，3个锌指结构的序列几乎完全一致。每个锌指结构的α螺旋与DNA双螺旋的大沟结合，其中α螺旋中特异的碱基与DNA大沟中充满鸟氨酸的三碱基位点结合[4]，这3个串联重复排列的锌指结构域就可与DNA识别位点上的相邻9个碱基进行结合，并具有一定的周期规律。

而KLF3蛋白因子上锌指结构域之间由一段特征性的高度保守的连接序列Thr-Gly-Glu/Ile-Lys-Pro链接,此段蛋白链接骨架在锌指结构结合DNA序列前后的物理特性发生变化，结合后变得坚硬化，从而使得KLF3与目的序列结合的亲和性、特异性及稳定性增强[5](如图1所示)。

KLF3的N端为一转录抑制区域，在该转录抑制区域中含有1个Pro-Val-Asp-Leu-Thr的模式作用区，对于介导KLF3因子与其他蛋白因子相互作用，此转录抑制区域与CtBP蛋白结合区域序列Pro-X-Asp-Leu-Ser基本一致[6]；KLF3将转录抑制子C-末端结合蛋白(CtBP)募集到靶基因的启动子，因此被认为主要作为转录的阻遏物[7]。除了与CtBP的相互作用外，完全抑制活性还取决于苏素化[8]。

KLF3可以通过苏素化进行修饰，进而影响蛋白质定位和功能的过程。苏素化涉及将小泛素样修饰物(SUMO)多肽加入位于共有基序C-赖氨酸-X-谷氨酸中的特定赖氨酸残基，其中C是疏水残基，而X可以是任何氨基酸[8]。经检测发现哺乳动物KLF3序列显示存在符合该共有基序的2个基序,这些基序是VKQE，分别定位于K10和IKIE处的赖氨酸残基与小鼠K197位置的赖氨酸残基和人的K198。与定点诱变相结合的体外和体内苏素化测定证实，可以通过添加SUMO来修饰这些位点,发现共有基序的赖氨酸或谷氨酸残基的突变足以防止苏素化的发生。

图1 KLF3锌指与DNA结合图[9]

2 KLF3基因对肌肉基因调控的效应

KLF家族的因子在肌肉细胞的发育过程中扮演重要角色[10]。Cullingford等研究表明，心肌细胞在接受应激刺激时,向细胞肥大或者凋亡方向进展时，KLF3的表达变化突出，推测KLF3基因的表达对平滑肌细胞的发育分化起到一定影响[11]。Himeda研究发现，KLF3在骨骼肌细胞分化的生物学进程中也起到了调控转录的作用[12]，通过蛋白质组筛选得知,在肌肉肌酸激酶(MCK)的启动子附近存在大量KLF3，进一步的各项实验均发现位于MCK启动子周围的KLF3结合该启动子，在一定条件下也可被其转录激活。要激活MCK活性单独依靠KLF3是不行的，还需要依赖于在MCK因子启动上募集的血清应答因子(SRF)。两者的特定作用区域同时与MCK的启动子结合，启动了MCK的转录。经检测KLF3转录物和蛋白质在肌肉分化期间增加，并且KLF3在内源性肌肉基因的启动子处富集。总之，这些研究表明KLF3在肌肉基因调控中发挥着重要作用，为进一步调控动物肌肉发育提供基础，改良动物肉质方面生长性状。

3 KLF3基因对脂肪分化的作用研究

2008年，在研究KLF3基因敲除的实验中表明了KLF3对脂肪生成分化过程中起作用[13]。在这个研究中，研究人员利用遗传工程小鼠为实验模型，通过对KLF3因子C端结合DNA的锌指结构的靶向性敲除手段来剔除了KLF3基因，结果显示敲除后小鼠的出生率虽然下降，但出生的小鼠经器官和体重检测，相比同窝出生的正常小鼠，KLF3基因敲除小鼠在体型方面偏小。经过进一步的检测发现小鼠体内脂肪垫中白色脂肪组织的体积和细胞减少。此外，通过称量其他几个器官，然后相对于小鼠体积做校正之后,发现似乎只有脂肪组织受到影响。这对于现在普遍的肥胖症等治疗提供了参考。

从细胞层面分析，小鼠的胚胎成纤维细胞(MEFs)用促脂肪生成混合物处理之后，被敲除KLF3基因的MEFs与正常的细胞比较在分化时更偏向于向脂肪细胞分化。这表明KLF3因子有抑制脂肪细胞生成的作用。

在对脂肪细胞细胞系3T3-L1中诱导分化的研究时,KLF3因子的mRNA、蛋白表达水平化等的上调会抑制该细胞系向脂肪细胞分化[14]。通过进一步的机制研究显示，KLF3通过抑制C/EBPα基因的表达抑制脂肪细胞分化。在秀丽隐杆线虫中的研究表明，KLF3通过调控脂肪酸去饱和途径基因的表达水平，参与调控维持正常脂肪酸复合物的形成[15]。此外，KLF3是调控脂蛋白组装、分泌和脂肪酸β-氧化的重要基因，KLF3中的突变分别降低秀丽隐杆线虫dsc-4及vit基因的表达，而dsc-4和vit-5中的突变导致蠕虫肠中的高脂肪积累。所以KLF3和dsc-4以及vit-5基因之间的遗传相互作用表明，KLF3可能在调节脂质组装和分泌中起重要作用[16]。2015年，王海霞等利用实时定量PCR和过表达技术研究了KLF3基因在脂肪细胞中的表达规律以及对鸡脂肪细胞的影响效应。结果表明，KLF3和已经报道的哺乳动物及线虫中KLF3相似，在肉鸡脂肪组织生长发育中至少具有2个功能，即抑制脂肪细胞分化和调控脂类合成代谢[17]。翟博等为了深入认知KLF3基因通过miRNA调控对脂肪形成与分化所起到的作用，找到了调控其基因的miRNA，并分析出该途径在脂肪发育过程中的调控机制，为动物脂肪沉积等方面的研究提供了基础和思路。具体结果为，miR-21抑制剂可以抑制KLF3基因3′-UTR荧光素酶报告载体的活性，这一抑制作用主要是因为miR-21与KLF3基因3′-UTR的相互作用而产生的；而当对结合位点突变以后，抑制作用消失，这样的实验结果说明了miR-21与KLF3基因3′-UTR之间存在的相互作用，并且可推断出miR-21与KLF3基因均对脂肪细胞的分化有相关性[18]。

4 KLF3基因在家畜育种中的应用

2010年，Yin等[19]通过对牛染色体6的QTL精细定位结果[20]，选择KLF3基因作为候选基因，以评估其对中国荷斯坦牛泌乳品质的影响。通过PCR产物的直接测序证实KLF3基因的外显子4中的SNP(NC_007304：g.13849G>C)。通过使用305 d的哺乳期记录收集每头牛的产奶量，包括产奶量，脂肪含量，蛋白质含量，脂肪百分比和蛋白质百分比。在中国的荷斯坦牛群中进行了SNP基因型与牛奶生产性状的进一步关联分析，包括1417头奶牛。发现该SNP位点与牛奶产量(P=0.022)和蛋白质产量(P=0.033)显著相关。CC基因型的影响显著高于其他基因型(P<0.05)。该研究表明，KLF3基因可用于标记辅助选择，作为荷斯坦奶牛育种中产奶量，蛋白质含量的分子标记基因。西班牙纯种马，也被称为安达卢西亚马，步态和体型可用作早期选择标准来检测具有前瞻性表演能力的幼马。研究者发现了1个KLF3基因上的SNP位点(rs68512502)并将其与马的生长性状相关联分析，包括了144匹马。发现该位点与马的体长和后管围显著相关(P<0.05)。表明该基因多态性可用于标记辅助选择(MAS)，以改善期望的体型特征[21]。2017年，朱才业[22]利用选择信号检测方法，将每个显著的SNP位点向上下游各扩展50 kb作为一个受选择的区域,在阿勒泰羊上检测出与脂肪相关的KLF3基因，为对阿勒泰羊的分子育种提供了候选基因。Pértille等[23]通过DNA测序及探针法检测了鸡KLF3基因的多态性与生长性状相关联分析，发现在鸡4号染色体的KLF3基因的第一和第二内含子之间发现1个SNP位点T>C，并与内脏体重和胴体重等生产性状显著相关。

5 小结与展望

KLF3基因在组织中广泛表达，参与到癌症[24-26]、脂肪细胞分化、血液中红细胞生成[27]、免疫B细胞的发育[28-29]、心血管发育[30]、肌肉基因调节等众多生物学进程。其对机体脂肪分化有抑制作用并影响到脂类物质的合成代谢，而对肌肉尤其是骨骼肌细胞分化起到的重要作用，使其作为一动物育种的重要候选基因，可用于人们对动物生长发育的相关经济性状进行有益的筛选改善。但目前存在的问题，一是对KLF3基因调控肌肉发育分化方面的研究较少，其作用机制尚不明确，如何通过调控KLF3基因来对其产生影响鲜有研究；二是缺少KLF3基因与动物生长性状关联性研究。对KLF3基因调控等生物学效应的深入研究，能为我国肉用动物育种工作提供极大的帮助。