向航 马洪 段晓峰

IGFBP-3在唾液腺多形性腺瘤中的表达及意义

向航 马洪 段晓峰

目的研究胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP-3)在唾液腺多形性腺瘤(SPA)中的表达。方法采用Western blot检测IGFBP-3在40 例SPA、40 例正常腺体组织及10 例恶性唾液腺肿瘤组织中的表达。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测IGFBP-3 mRNA在50 例SPA组织、50正常腺体组织及10 例唾液腺恶性肿瘤中的表达。结果IGFBP-3蛋白在唾液腺正常组织(N组:8.54±3.95)的表达(A值)显著高于多形性腺瘤组(PA组:4.78±2.07)及恶性肿瘤组(CA组: 3.63±2.27)(Plt;0.05)。而PA组与CA组之间则不存在显著差异(Pgt;0.05)。IGFBP-3 mRNA在SPA组织与恶性肿瘤组织中的表达均低于正常组织(PA/N组：0.654±0.387，CA/N组:0.452±0.229),PA组与CA组不存在显著差异(Pgt;0.05)；不同包膜浸润程度的多形性腺瘤组织中相对含量的差异有统计学意义(Plt;0.05)，在年龄、性别及有无复发上无明显差异。结论IGFBP-3在多形性腺瘤中的低表达可能减低了拮抗IGF-1R的作用，引起肿瘤细胞的增殖，促进肿瘤形成。

胰岛素样生长因子结合蛋白3； 涎腺多形性腺瘤(SPA)； 蛋白免疫印迹； 实时荧光定量PCR

多形性腺瘤(pleomorphic adenoma, PA)是唾液腺肿瘤中最常见的一种,占唾液腺上皮性肿瘤的50%以上，占全部良性肿瘤的87%以上[1]。学者在腮腺肿瘤的回顾性分析中发现，多形性腺瘤在其中构成比最大[2]。该肿瘤虽为良性，但其包膜不完整且常有肿瘤细胞浸润，极易恶变和术后易复发[3]。研究表明，肿瘤的发生与发展被认为是多基因共同作用的结果，这些基因在肿瘤细胞的生长、增殖、分化、凋亡等多个方面发生作用。胰岛素样生长因子结合蛋白3(insulin-like growth factor-binding protein 3，IGFBP-3)是IGF信号通路的重要调节因子[4]。IGFBP-3在结肠癌、卵巢癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤中均有异常表达[5-9]。本研究应用Western blot及Real-time PCR检测IGFBP-3蛋白及mRNA在多形性腺瘤中的表达情况，并比较其在不同临床特征组中表达的差异及意义。

1 材料与方法

1.1 组织标本

标本取自贵州医科大学附属医院颌面外科及贵州省肿瘤医院2013-03～2015-10手术切取新鲜组织,PA组50例标本其病理类型经病理证实为多形性腺瘤；50 例正常组(N组)组织取自多形性腺瘤边界1 cm以外正常腺体组织；CA组10 例组织取自术后病理证实为唾液腺恶性肿瘤。所有新鲜组织离体后，一部分立即RNA Later封存，一部分PBS清洗后，-80 ℃冰箱保存待用。标本的获取经伦理学会审核同意。

1.2 试剂及仪器

鼠抗人IGFBP-3单克隆抗体、小鼠抗人β-tubulin单克隆抗体、羊抗鼠HRP标记二抗(Abmart公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(Beyotime)，Millipore Immobilon Western 化学发光HRP底物,Synergy H4全功能酶标仪，组织细胞破碎仪(bullet blender)，Bio-rad Mini-PROTEAN电泳转膜系统，数字成像分析系统。RNAlater组织固定液、Dynabeads mRNA DIRECTTMKit(Ambion公司)；逆转录试剂盒Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit和PCR反应荧光 Light Cycler480 SYBR Green ⅠMaster(Roche公司)；CFX connect Real Time System PCR扩增仪(BIO-RAD)。

设计及合成目的基因及内参基因引物。IGFBP-3上游：5'-3' TTCCAGTAGTCAGCAAAGAGCA；下游：3'-5' CCGCCTAAGTCACAAAGTCAGT。内参基因GAPDH上游：5'-3' CAGGAGGCATTGCTGATGAT，下游：3'-5' GAAGGCTGGGGCTCATTT。购于生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 蛋白免疫印迹(Western blot) 切取50 mg组织,加入细胞裂解液(含PMSF)，利用组织破碎仪裂解组织，提取总蛋白(-20 ℃储存备用)。BCA法测定总蛋白浓度，统一上样量每孔40 μg,聚丙烯酰胺凝胶电泳(分离胶浓度10%，浓缩胶浓度4%),恒压冰浴电转至PVDF膜，5%牛奶封闭2 h，转入一抗稀释液(IGFBP-3为1∶5 000，β-tubulin为1∶2 000)，4 ℃孵育过夜。TBST洗涤后，加入辣根过氧化物酶标记过的二抗稀释液(1∶8 000)，室温摇床2 h后TBST洗涤。Immobilon Western 化学发光HRP底物检测抗体结合，暗室内显影，显色条带扫描后通过数字成像系统Image J进行光密度扫描分析。计算蛋白相对A值=A(IGFBP-3)/A(β-tubulin)。

1.3.2 聚合酶链式反应测定mRNA(Real-time PCR)

利用Dynabeads mRNA DIRECTTMKit试剂盒提取组织mRNA：取存储在RNAlater试剂(-80 ℃)中的组织2～10 mg于LB裂解液(含蛋白溶解酶K)中，55 ℃恒温促进组织消化。加入Dynabeads Oligo[dT]25使磁珠与mRNA结合，摇床10 min后立即放入磁场中。移除上清液，依次用Washing Buffer A/B液洗涤，去除上清。加入Tris-HCl(pH 7.5)溶解磁珠，80 ℃恒温2 min得到mRNA。将提取出的 mRNA与Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(Roche公司)的cDNA Synthesis Master Mix混合，放入热循环仪中逆转录，42 ℃维持30 min，85 ℃失活5 min，4 ℃保持5 min。将循环结束后获得的cDNA用Nanodrop 2000分光光度计测得浓度及纯度，将其稀释后与Light Cycler 480 SYBR Green Ⅰ Master混合进行扩增：SYBR Green 5.0 μl，上下游引物4.0 μl，模板1.0 μl。用CFX connect Real Time System PCR仪进行实时扩增，反应条件为：95 ℃，10 min，变性95 ℃，15 s，退火65 ℃，10 s，共60 个循环。每个样品3 个复孔，取Ct平均值。采用2-ΔΔCT法进行结果分析，计算相对表达量ΔCt=Ct(tag)-Ct(ref)，ΔΔCt=ΔCt(肿瘤组)-ΔCt(正常组)。

1.4 统计学处理

检测结果结合临床资料数据，应用SPSS 21.0软件包进行统计分析，Plt;0.05被认为有统计学意义。

2 结 果

2.1 Western blot检测IGFBP-3蛋白的表达

图1～2的检验结果可以知道，IGFBP-3在正常腺体组织(N组)中蛋白相对A值为8.54±3.95，在多形性腺瘤组织(PA组)中为4.78±2.07，在唾液腺恶性肿瘤组织(CA组)中为3.63±2.27。经统计分析后得出，N组IGFBP-3表达量显著高于PA组(t=6.36，P=0.000)及CA组(t=3.756，P=0.000)，差异有统计学意义。而PA组与CA组之间则不存在显著差异(t=1.531，P=0.132)。

图 1 IGFBP-3蛋白在唾液腺正常腺体组织、多形性腺瘤及恶性肿瘤中的表达

Fig 1 The expression of IGFBP-3 protein in normal tissue, pleomorphic adenoma and carcinoma of salivary gland

2.2 Real-time PCR 检测mRNA的表达结果

经统计分析，IGFBP-3在唾液腺多形性腺瘤组织与恶性肿瘤组织中的表达均低于正常组织(多形性腺瘤组/正常组：0.654±0.387，恶性肿瘤组/正常组:0.452±0.229)，而多形性腺瘤中的表达较恶性肿瘤组无明显差异(Z=-1.349，P=0.177gt;0.05)。在临床相关性分析中，IGFBP-3在有无包膜浸润的多形性腺瘤组织中相对含量的差异有统计学意义，与患者的年龄、性别及是否复发无明显差异(表 1)。

图 2 唾液腺正常腺体组织、多形性腺瘤及恶性肿瘤中IGFBP-3的蛋白相对表达量比较

Fig 2 Comparision of the expression of IGFBP-3 protein in normal tissue, pleomorphic adenoma and carcinoma of salivary gland

表1 IGFBP-3 mRNA表达与多形性腺瘤的临床相关性

Tab 1 Association between IGFBP-3 mRNA expression and clinical characteristics in patients with pleomorphic adenoma

组别nx±sZ值P值性别 男160.716±0.387-0.7690.442女340.625±0.389年龄 lt;60岁380.679±0.396-0.8630.388≥60岁120.577±0.362浸润包膜是220.501±0.324-2.4040.016否280.775±0.394复发 有80.664±0.320-0.1320.895无420.653±0.401

3 讨 论

胰岛素样生长因子(insulin_like growth factors，IGFs)信号系统由IGF配体、IGF受体及IGF结合蛋白(IGFBPs)组成。IGF系统促增殖生长的活性主要由IGF-1R介导，可促进肿瘤细胞增殖，抑制凋亡。IGFBP-3可以通过限制的IGF-促有丝分裂和细胞存活的动作限制肿瘤的生长和发展[10]。IGFBP-3比IGF-IR有更大的亲和力，可以竞争性的结合IGF配体，拮抗IGF系统中主要作用促细胞增殖及抑制凋亡的IGF-1R，并可以调节在许多细胞类型的IGF动作。IGFBP-3可以通过限制IGF-1R促有丝分裂和细胞存活的动作限制肿瘤的生长和发展[11]。

本文结果表明IGFBP-3蛋白和mRNA在多形性腺瘤及恶性涎腺肿瘤中表达均较正常腺体组织低，在多形性腺瘤及恶性肿瘤组织中表达无明显差异。结果与其在肺癌[12]、食管鳞癌[13]、恶性黑色素瘤[14]中表达下调具有一致性。推测多形性腺瘤作为临界瘤，其发生发展在分子水平的表现上可能与恶性肿瘤具有一定的相似性。在临床相关分析中，IGFBP-3在有无包膜浸润的多形性腺瘤中有明显差异，有包膜浸润时其表达较无包膜浸润更低。IGFBP-3的低表达，可能使唾液腺肿瘤在发生发展中对肿瘤细胞生长的抑制降低，促细胞有丝分裂，细胞增殖，最终引起肿瘤发生发展。但其在涎腺肿瘤中通过何种路径被激活至发挥生物学作用，有待进一步实验研究。

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(收稿： 2016-07-09 修回： 2016-12-23)

TheexpressionandsignificanceofIGFBP-3insalivaryglandpleomorphicadenoma

XIANGHang，MAHong，DUANXiaofeng.

550004Guiyang,OralandMaxillofacialSurgery,TheHospitalAffiliatedtoGuizhouMedicalUniversity,China

Objective: To investigate the expression of insulin-like growth factor binding protein 3(IGFBP-3) in salivary pleomorphic adenoma(SPA).MethodsThe expression of IGFBP-3 protein in 40 cases of SPA(group SPA), 40 of normal glandular tissue(group N) and 10 of salivary gland malignant tumor(group CA) was detected by Western blot. The expression of IGFBP-3 mRNA in 50 cases of SPA, 50 of salivary gland normal tissue and 10 of CA was detected by qRT-PCR.ResultsThe expression(A value) of IGFBP-3 protein in group N, SPA and CA was 8.54±3.95, 4.78±2.07, 3.63±2.27 respectively. The expression ration of IGFBP-3 mRNA of group NvsSPA or CA,Plt;0.05; SPAvsCA,Pgt;0.05(SPA/N was 0.654±0.387, CA/N: 0.452±0.229) respectively，but showed no significance difference between SPA and the CA groups(Pgt;0.05). Difference of IGFBP-3 mRNA expression was observed with different envelope infiltration of SPA(Plt;0.05), no significant difference was observed in different age，gender or relapse groups.ConclusionIGFBP-3 Low expression of IGFBP-3 in pleomorphic adenomas may reduce the antagonism of IGF-1R, causing the proliferation of tumor cells and promote tumor formation.

Insulin-likegrowthfactorbindingprotein3(IGFBP-3);Salivarypleomorphicadenoma(SPA);Westernblot;Real-timePCR

贵州省科技厅社会发展项目(编号： 黔科合[2013]3012号)

550004 贵阳, 贵州医科大学附属医院口腔颌面外科

马洪 E-mail：mahong1966@126.com

R739.8

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.02.025