殷 珂 , 姜忠玲 ， 丛 霞 ， 曹荣峰 ， 田文儒 ， 李华涛

(青岛农业大学动物科技学院 ， 山东 青岛 266109)

犬输血安全及血型检测问题探讨

殷 珂 , 姜忠玲 ， 丛 霞 ， 曹荣峰 ， 田文儒 ， 李华涛

(青岛农业大学动物科技学院 ， 山东 青岛 266109)

输血可迅速补充循环血量和体液量，增加有效血容量，维持血压，改善血液循环状态；并增加机体血细胞，增强携氧能力，同时增强机体抗感染能力和激发体内凝血因子及增强骨髓造血机能改善贫血等。大量临床实践表明，很多病例都需要输血治疗，例如急性失血、脱水导致大量体液丧失、血液寄生虫病(牛蜱热)、各种症状的贫血、中毒性休克、血友病、白血病及细菌或病毒引起的危重病例等。

但在我国动物疾病诊疗中，血液学和动物血库方面的知识储备很少，宠物主人对动物捐血或输血治疗的知识十分匮乏。一方面没有定期具有身体健康合格的宠物捐血，另一方面也没有为自己饲养的宠物检测血型，一旦需要输血时再来检测血型，并且短时间内难找到需要的血型血液，往往会延误治疗。

1 动物输血在我国动物疾病诊疗中存在的问题

1.1 急需建立动物血库 输血是现代外科手术、急救医疗以及某些疾病治疗的重要一环。输血成为常规医疗手段的前提是拥有经常性的用血储备，亦即有血库的存在。犬、猫作为人类的好朋友在人类生活中扮演着重要角色，在特殊条件下常需输血急救。美国发达国家地区都有动物血库，在中国香港2009年动物福利组织建立了首个动物血库，但因场地和资金不足在2011年被迫关闭，目前国内尚无犬血库。国内各地因输血需求纷纷自发组织建立犬、猫等移动式宠物互助血库，但由于多种因素导致很难维持。美国等发达国家和地区有专门的部门、机构建立动物血库，为动物救治供血，我国只有部分动物医院饲养供血动物。因此，中国急需建立一个动物血库平台，提高动物福利水平，提高人民幸福指数。

1.2 动物输血应用存在风险问题 由于在中国还没有可以利用的动物血库平台，同时也缺乏动物疾病诊疗中输血用血液制品应用标准。各地的宠物医院为了解决临床中输血难题，部分动物医院自己饲养供血动物，以供输血用。大大增加了因血型不合引起的输血风险，引起宠物医疗纠纷，还能通过输血传播血液寄生虫和传染病。因此急需建立一套与血库平台配套的动物血液制品的质量评价标准和输血技术的参考标准。

1.3 动物输血急需解决的技术问题 动物血液资源库和技术平台：需要建立一套供血动物健康状况的评价标准，主要针对供血动物血型、血液寄生虫和传染病的筛查，以及供血动物品种，年龄，体重的要求。建立一套采血，血液制品处理，保存的实验室技术参考标准，以及针对动物用血液制品的质量评价标准。

动物输血治疗技术参数：急需制定一套输血技术参考标准，制定主要针对血液制品的类型及输液方式，所用输血治疗中的专用医疗耗材(输血专用输液器)，输血前后的检查和监测方法，出现输血风险和紧急情况的处理方法和急救措施。

2 犬通过血液传播的疾病及检测方法

国际动物血液资源库要求，所有提供犬输血所用的血液制品，必须来源于经过全身体检的犬，要求供血犬不含可以经过血液传播的血液寄生虫疾病。在中国宠物临床中少数输血案例中，均不进行这些项目的检测，因此输血医疗存在的风险也相对较大。此外，犬的传染性疾病更为复杂，犬瘟热等血液带毒的疾病对输血医疗也存在较大的风险。

对于犬瘟热和细小病毒的检测，在宠物临床上应用较多的是胶体金检测试纸，但在国内外也建立了多种分子生物学检测方法，包括PCR、LAMP、荧光抗体等方法[1-3]。在中国2006年发现犬流感流暴发，国内外相继也建立了PCR、RT-LAMP检测方法用于犬流感病原的检测[4]。

经媒介昆虫传播的血液寄生虫疾病，国内针对不同的血液寄生虫已经建立了很多相关的实验室检验方法。针对犬恶丝虫的有Dot-ELISA、PCR、ELISA、胶体金免疫试纸等检测方法[5-7]。犬巴贝斯虫有PCR、血涂片、免疫荧光鉴定方法[8-9]。现有的犬的无形体检测手段仅仅是通过血涂片进行检测但其灵敏度根本达不到临床的需要。针对寄生虫和细菌等引起的疾病在中国临床检测中的分类也很不清晰，很多时候均混为一谈。大多认为是附红细胞体或埃利希体疾病进行诊治。但由于很多犬血液寄生虫形态学相似，血涂片检测会判断不够准确，免疫荧光的检测可能会产生交叉反应出现非特异性的结果。因此对于很多类型的犬血液寄生虫疾病，现有的检测方法都满足不了临床检测的要求。因此更特异、更灵敏、方便、便宜的临床检测急需要被建立起来。

3 犬血型分类及鉴定方法

3.1 犬血型的分类 犬的血型和人类的血型一样，是具有种属特异性和抗原性的红细胞表面的遗传标记，即犬红细胞表面抗原，其实质多为糖蛋白。犬的红细胞抗原种类繁多，血型分类也比较复杂。犬具有很多血型基因，每种血型基因独立遗传，相互之间互不影响，可以在同一犬的红细胞上可以同时出现多种血型的组合。犬红细胞表面抗原(DEA)，即血型系统是按照阿拉伯数字排序来分类的。

人们最初对犬血型的研究兴趣主要是以犬作为动物模型研究输血过程中产生的免疫反应而破坏红细胞。Swisher等在1949-1961年第一次系统的研究了犬的血型[10-12]。随后又报道了另外6种犬的血型系统[13-15]方面进行系统全面的阐述。至今为止，共描述了13种不同的犬血型系统，其中经国际标准确认的为8种[16-17]，分别为DEA1.1、DEA1.2、DEA3、DEA4、DEA5、DEA6、DEA7、DEA8[18-19]。犬的血型鉴定在很多实验室都是一个常规的服务项目，主要目的为了安全的输血治疗。

在DEA1.1系统中，至少有DEA1.1和DEA1.2两种亚型，经研究确定其为等位基因。因此，犬DEA1.1和DEA1.2两种血型抗原不能同时出现阳性和阴性。所有的DEA中，DEA1.1、DEA1.2和DEA7具有较强的免疫原性。其中DEA1.1和DEA1.2的抗原-抗体反应是导致急性输血性溶血的最主要因素。现在报道犬的血型频率的文章非常有限，有些血型很少见(比如DEA3)，。在所有的犬血型中，常见血型DEA4和DEA6出现率高达98%，DEA4和DEA6的抗原-抗体反应对输血的红细胞没有任何影响(表 1)。所以，如果某只犬只有DEA4和DEA6，而没有其他血型抗原，则可以作为万能供血者。

在犬的血型系统中，不相容性的血液输血后产生的溶血性输血反应会比兼容性的血液快，会在输血后4～5 d内产生溶血反应，因此被称为迟发性溶血反应。相比急性溶血性输血反应，它所带来的后果并不严重，因此交叉配血在犬的首次输血时其实并不需要。

表1 犬血型的基本情况

3.2 犬血型鉴定方法 近年来，输血医学在兽医实践中迅速增长，让人们进一步认识了输血前血型鉴定的重要性[20-21]，新的血型监测方法不断涌现。科学家们依据红细胞表面抗原在特异抗体存在时会发生红细胞凝集的这一普遍原理，积极探索能够引起特定抗原红细胞凝集的凝集素，甚至研究过植物凝集素的分型效果。已报道的13种犬血型中，现在仅能够买到5个血型系统的犬血型抗血清。国际上可以用多克隆抗血清进行血型鉴定的犬血型有DEA1.1、DEA1.2、DEA3、DEA4、DEA5、DEA6、DEA7和DEA8，但是由于保存等原因，现在已经没有DEA6和DEA8血型抗血清了[22]。Andrews等在1992年成功研制出了抗DEA1.1血型定型鼠单克隆抗体[23]。随后，宠物血液库等机构相继推出了可以检测DEA1.1和DEA1.2的血型试剂盒，可以轻易区分DEA1.1、DEA1.2和DEA1-，从而基本满足了临床上对血型测定的要求。

现在可用的动物血型分型的方法都是基于红细胞抗原和单克隆试剂或多克隆血清的血凝反应原理实施的。在人类医学中，血型检测可以通过试管法、载玻片法、微孔板法和凝胶柱法进行鉴定。在兽医临床输血治疗中，血清学方法鉴定血型所用的方法和人类医学相似，其中存在有试管法、卡片法和凝胶柱法等。商业化可用的针对犬和猫的血型检测试剂，血型检测卡在20世纪90年代面世并且不管在实验室或临床诊疗中都已经标准化，是惟一合理的可以用于犬血型检测的方法，但对于犬的血型仅能够测试DEA1.1血型并且犬中也有检测错误的报道[24-25]。现在，作为替代方法的新型的凝胶柱凝集测试血型检测方法可利用凝集反应来判断血型的类型。目前广泛使用的快速、简便血型检测方法就是血型检测试剂盒，遗憾的是中国大陆还没有开展血型检测的业务。

在2005年，科学家分别对犬和猫比较了多种血型分型方法[24-25]。结果表明，这些不同的检测方法具有良好的相关性，都能很好的检测鉴定犬猫的血型。目前，发展犬血型基于DNA为基础的PCR检测方法很有必要。对犬血型的研究应该集中在血型基因型方面会更有意义。

经过血型鉴定后，为了进一步确定需要输注的血液产品符合输血的要求，需要做一个交叉配血实验验证供血犬血液和受血犬血液的相容性，验证供血者和受血者之间的血清学是否兼容。在优化的历程中包括多个快速检测技术，如：试管法、凝胶柱法、载玻片、试管凝集、盐水凝集、间接抗球蛋白试验方法以及凝胶柱凝集方法。

3.3 制备犬血型单克隆抗体存在的技术问题 输血前进行血型鉴定具有很重要的临床意义。然而，犬的血型鉴定中缺乏相应的单克隆抗体，多克隆抗体的获得也相当困难，需要进行大量血型已知的红细胞样本筛选才能够确定是否可用。由于缺乏强有力的筛选方法，至今国际上存在的仅有Andrews等在1992年研制出了DEA1.1血型定型单克隆抗体，[23]要得到大量可以用于血型鉴定的单克隆抗体，必须解决抗体筛选方法的难题。而如今对犬的血型基因、蛋白结构等信息所知甚少。也无法纯化得到较为单一的犬血型抗原。没有单一的免疫原，也建立不了较为强大的Elsia筛选方法。用现在成熟的鼠单克隆抗体制备技术制备抗体，也是一个非常大的挑战。

试剂红细胞包括ABO反定型用的试剂红细胞、各种红细胞谱细胞(Panel cell RBC)及特殊或稀有血型红细胞，用于血型鉴定、红细胞血型抗体研究和检查红细胞抗体等方面，这些红细胞血型抗原十分宝贵，也是难得的必备工作试剂[26]。所有的血型血清学实验室都是必须常规配备的。目前，绝大多数血型血清学实验室使用的试剂红细胞，主要是全血经生理盐水多次洗涤，再添加一定量的红细胞保存液后而制成。目前反定型检测使用试剂红细胞，由于其易溶血、保存期短等原因，试剂质量难以保证，由此导致ABO血型反定型检测至今未达到规范化、标准化。

现在技术中所建立的红细胞抗体检测方法和血型抗体筛选方法都避免不了用到试剂红细胞但其不能够长期保存，这样进一步加大了血型抗体的筛选工作难度。大大限制了宠物医疗中输血治疗方法，急需研究出一个常规的方法，既可以长期保存血型抗原，又可以高通量的进行血型抗体的检测，可以用多种犬的红细胞来对多克隆抗体和单克隆抗体进行筛选。

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2017-01-16

国家自然科学基金(31502138，31572590)；山东省自然科学基金(BS2015NY001)；山东省高等学校科技计划项目(J15LF03)

李华涛，E-mail:htli1986@hotmail.com