徐晓丽 ， 叶红梅 ， 侯纯强 ， 蔡 琰 ， 钟文慧 ， 李贺密

(1.天津市水产技术推广站 , 天津 河西 300221 ; 2. 天津渤海水产研究所 , 天津 经济技术开发区 300457)

半滑舌鳎弧菌病病原的分离鉴定

徐晓丽1， 叶红梅1， 侯纯强2， 蔡 琰1， 钟文慧1， 李贺密1

(1.天津市水产技术推广站 , 天津 河西 300221 ; 2. 天津渤海水产研究所 , 天津 经济技术开发区 300457)

从患病半滑舌鳎(Cynoglossussemilaevis)内脏中分离到2株优势菌株，人工感染试验证实菌株150803对半滑舌鳎具有致病性；采用形态学观察、生理生化特性分析、16S rRNA等方法对所分离菌株进行鉴定，结果显示，菌株150803为革兰阴性杆菌，生化特性与溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)较为接近，以hsp60基因为遗传标记构建的系统发育树将菌株150803与溶藻弧菌聚为一支，置信度为99%，采用特异性引物扩增溶藻弧菌dnaJ基因得到预期144 bp的基因片段。综合以上结果判定引起此次半滑舌鳎发病的病原为溶藻弧菌。对22种抗菌药物的敏感性试验表明，菌株150803对恩诺沙星、环丙沙星、庆大霉素、菌必治敏感，对氟苯尼考、呋喃唑酮、苯唑青霉素等具有抗性。

半滑舌鳎 ; 溶藻弧菌 ;hsp60 ;dnaJ

半滑舌鳎(CynoglossussemilaevisGünther)隶属于鲽形目、舌鳎科、舌鳎属，是近海一种大型暖温性底栖鱼类，性状优良，抗逆性强，适应温度盐度范围广，生长速度快，且肉质细腻，味道鲜美，含有丰富的不饱和脂肪酸，深受广大消费者青睐，市场价格居高不下，是山东、河北、天津、辽宁等地区工厂化养殖的主导品种。但在2011年半滑舌鳎养殖业受体表溃疡病及腹水病的影响，一度产量急剧下降，2015年才有所恢复，通过降低养殖密度、改善循环水系统，这两种疾病得到了较好的控制，但新的病害又开始出现。2016年8月，河北曹妃甸养殖半滑舌鳎出现大量死亡现象，死亡率达50%以上，均为30 cm左右的较大型个体，损失巨大。为查明该企业半滑舌鳎死亡原因，本研究取患病半滑舌鳎进行病原分离，得到2株优势菌株，采用形态学、生化特性分析结合16S rRNA基因及hsp60基因对所分离的菌株进行鉴定，并对其致病性及药物敏感性进行分析，旨在探究半滑舌鳎的发病病原及其特性，为该病的诊断与防治提供科学参考和依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 发病半滑舌鳎取自河北曹妃甸某工厂化养殖车间，体长30±3 cm；健康半滑舌鳎取自天津市兴盛海淡水养殖有限责任公司，全长(16±2) cm，体质量(40±3) g，暂养于75 L塑料整理箱，水温25 ℃，盐度2%。2216E、TSB培养基、血平板、弧菌科细菌生化鉴定管、药敏纸片，均购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.2 病原菌分离 取濒死半滑舌鳎，刮取体表黏液、鳃及鳍溃烂处组织等制作水浸片镜检是否有寄生虫及真菌。剖检病鱼，观察内脏器官病理变化，取接种环从病变处(肝脏、眼睛、肠道等部位)接种细菌，划线接种于2216E平板/血平板；无菌操作取病鱼胆汁涂布于血平板，28 ℃培养24～48 h后，挑取形态一致的优势菌落进行纯化培养，直至获得纯培养菌株，以TSB冻存液(含15%甘油的TSB培养基)保存于-80 ℃备用。

1.3 人工感染试验 本次从患病半滑舌鳎体内分离到2株优势菌株，用于进行感染实验。所用半滑舌鳎饲养于45 L玻璃缸中，分3组，2组为试验组，分别注射分离所得的两株菌株，一组为对照组，每组15尾鱼。

感染试验采用腹腔注射的方式进行，以含0.85% NaCl的生理盐水调整感染试验用菌株菌悬液密度为3×107CFU/mL，试验组每尾鱼注射0.2 mL菌液，对照组注射等量生理盐水。注射后连续观察实验鱼，每天正常饲养、换1/3水、吸污，记录半滑舌鳎的发病和死亡情况，并从人工感染发病的濒死鱼中，取患病症状与自然患病鱼相似的再次分离、纯化、鉴定细菌。

1.4 病原分离与生化鉴定结果 将纯培养的细菌划线接种于2216E平板、TCBS平板和血平板，28 ℃培养24～48 h后，观察菌落特征，挑取单菌落，制作细菌滴片进行革兰染色，观察细菌形态。将细菌接种于生化鉴定管，与《常见细菌系统鉴定手册》[1]以及《伯杰氏细菌学鉴定手册》[2]中所列细菌生化特性进行比对鉴定。

1.5 病原菌的分子生物学鉴定 分别采用扩增细菌的16S rRNA、hsp60基因构建系统发育树以及采用特异性引物扩增溶藻弧菌dnaJ 基因的方法对所分离菌株进行鉴定。

16S rRNA和hsp60基因序列的PCR扩增与测序 挑取纯培养细菌的细菌悬液，煮沸后瞬时离心取上清作为PCR反应的模板。16S rRNA和hsp60基因序列的扩增参照文献[3-4]所述方法进行，PCR产物由上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。

基因序列分析与系统发育树的构建： 将所分离菌株的16S rRNA和hsp60基因序列分别提交至GenBank 数据库，采用NCBI 的Blast 检索系统进行同源性分析，选取与所得菌株同源性较高菌株的基因序列，采用Clustal x 1.81软件比对，分别以16S rRNA和hsp60基因为分子标记，采用Mega 5. 2基于邻接法(Neighbor-joining，NJ法) 构建系统发育树，Bootstraps检测置信度，自举数集1 000次。

分离菌株的PCR鉴定： 采用特异性引物扩增溶藻弧菌dnaJ基因[5]，扩增结束后取3～5 μL 进行水平电泳，在凝胶成像仪下观察结果。

1.6 药物敏感试验 采用药敏纸片分析所分离菌株的药物敏感性，调整菌悬液密度为1.5×108CFU/mL，以无菌棉签蘸取菌液均匀涂布于MH平板，将药敏纸片均匀贴在培养基表面，28 ℃培养箱中培养24 h，记录各药敏纸片的抑菌圈直径(mm)，并按照药敏纸片抑菌范围解释标准判断试验结果。

2 结果

2.1 病鱼初检 发病的半滑舌鳎不食，反应迟钝，游泳异常，蹿高跳起，最后翘头翘尾而死；体表黏液增多如覆一层白絮，尾鳍溃烂，眼睛充血、突出；剖检发现病鱼鳃发白，鳃丝肿胀，烂鳃严重，肝脏出血、充血，腹腔内有血性腹水，胆汁发红，性腺有点状出血，肠道糜烂化脓，肠黏膜无弹性(图1)。镜检未发现鱼体表和体内有寄生虫。从患病鱼肝脏、胆汁、眼睛处分离到形态相近的菌株150802，该菌株仅在血平板上生长，且生长缓慢需培养48 h以上，不溶血；从肠道中分离得到形态一致的菌落150803，生长迅速，在TCBS培养基上为黄色圆形菌落，有黏性(见中插彩版图1、图2)。挑取单菌落进行纯化培养，分别冻存于-80 ℃。

2.2 致病性验证 感染试验结果显示，注射菌株150803的试验组鱼在感染第5天吃食明显减少，第8天开始出现死亡，至25 d该试验组鱼全部死亡。病鱼体表黏液增多，肝充血、发红，肠道有脓液，但无眼睛突出充血的症状，翘头翘尾死亡现象。注射菌株150802的试验组及对照组鱼无明显异常，无一死亡。从人工感染后发病的濒死鱼肠道脓液中接菌划线于TCBS平板，得到与感染用菌株150803形态一致的黄色菌落，经鉴定所分离菌株的理化特性与原感染菌150803一致，表明150803为本次半滑舌鳎死亡的病原菌。

2.3 生化鉴定 将纯培养的细菌划线接种于2216E平板培养，菌株150803生长迅速，划线后6 h即可长出肉眼可见的菌落，过夜培养后菌落直径在2 mm以上，革兰染色后菌体呈阴性短杆状，长1～3 μm，无荚膜；生化鉴定结果显示菌株150803具运动性，氧化酶和接触酶均呈阳性，发酵葡萄糖产酸，对弧菌抑制剂O/129(150 μg)敏感，进一步的生化鉴定结果显示，菌株150803 V-P反应阳性，还原硝酸盐，β-半乳糖苷酶、赖氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶均为阴性，淀粉酶、明胶酶、鸟氨酸脱羧酶均为阳性，能够利用蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露醇，不能利用肌醇、甘露糖、阿拉伯糖、水杨苷、乳糖等(表1)。将生化检测结果与《常见细菌系统鉴定手册》、《伯杰氏细菌学鉴定手册》弧菌属细菌及目前已分离到的溶藻弧菌菌株[6-10]的表型特征进行比较，结果显示，菌株150803与溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)最为接近。

表1 菌株150803和溶藻弧菌的生理生化特征的比较

+:阳性；-:阴性；V:可变

2.4 分子生物学鉴定 采用通用引物扩增所分离菌株的16S rRNA基因，得到1 500 bp的核酸片段。Blast分析结果显示，菌株150802与美人鱼发光杆菌杀鱼亚种(Photobacteriumdamselaesubsp.piscicida)16S rRNA 基因序列高度一致，相似度为99%；菌株150803与多株溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌等弧菌属细菌的16S rRNA 基因序列高度一致，相似度为98%以上，以16S rRNA基因为遗传标记无法将菌株150803准确鉴定到种。扩增菌株150803的hsp60基因，Blast分析结果显示，菌株150803与多株溶藻弧菌的相似度最高，以hsp60基因为遗传标记构建的系统发育树将150803与溶藻弧菌聚为一支(图3)，置信度为99%。且采用特异性引物扩增溶藻弧菌保守基因dnaJ，得到预期144 bp的基因片段(图4)。综合菌株150803 的形态、生化特征和16S rRNA、hsp60基因序列分析及dnaJ基因扩增结果，判定菌株150803为溶藻弧菌。

2.5 药物敏感性 在所试的22种抗生素中，菌株150803对恩诺沙星、环丙沙星、庆大霉素(120 μg/disc)、菌必治敏感；对强力霉素中度敏感；对氟苯尼考、呋喃唑酮、苯唑青霉素等具有抗性，结果见表2。

3 讨论

图3 以hsp 60基因构建的Vibrio 系统发育树

表2 菌株150803对抗菌药物的敏感性

S:敏感 Sensitive； R:抗性 Resistant； I:中度敏感Intermediate

图4 菌株150803 dna J基因PCR 产物电泳图

溶藻弧菌是一种常见的海洋条件致病菌，广泛存在于世界各地的海水中及江河入海口的水域之中，数量居海水类弧菌之首，与副溶血弧菌和哈维氏弧菌并称海水三大优势弧菌[6]。溶藻弧菌可对多种水生动物致病，迄今已陆续从养殖刺参(Apostichopusjaponicus)、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)、石斑鱼、皇姑鱼(Nibeaalbiflora)、大黄鱼(Larimichthyscrocea)、魁蚶(Scapharcabroughtonii)、对虾、牡蛎、南日鲍(Haliotisdiscusnanf)体内分离到该菌并通过回感试验证实溶藻弧菌对以上宿主的致病性[6-10]。该研究从发病死亡的半滑舌鳎肠道脓液中分离得到大量形态均一的菌落，经形态学、生化指标及分子生物学鉴定所得的优势菌株为溶藻弧菌，并通过回感试验证实该菌对半滑舌鳎的致病性，是溶藻弧菌对半滑舌鳎致病的首次报道。在该研究中，菌株150803的感染试验历时相对较长，可能因病原在肠道中的定植、大量繁殖、致鱼死亡需要相对长的时间；病死鱼并未出现眼球充血、突出、翘头翘尾的症状，据分析此症状可能与肝脏、眼睛处分离得到的另外一株菌150802有关，菌株150802的16S rRNA基因序列与美人鱼发光杆菌最为接近，也为已报道的半滑舌鳎的病原菌，可引起半滑舌鳎体表溃烂、鳍基部出血、内脏结节等[11]，该研究所得到的菌株150802生长速度较慢，单独进行回感试验时未引起半滑舌鳎发病死亡，未对其进行深入研究。

在细菌分类研究中，16S rRNA基因序列是最常用的遗传标记，但在该研究中菌株150803与副溶血弧菌、哈维氏弧菌、轮虫弧菌等的16S rRNA 基因序列相似度均在98%以上，无法将菌株鉴定到种。热休克蛋白hsp基因也是一种常用于生物进化及分类的遗传标记，Kwok等的研究表明，hsp60基因适合用于研究海洋弧菌系统分类[12]。该研究扩增了菌株150803的hsp60基因并构建了以hsp60为遗传标记的系统发育树，结果显示150803与溶藻弧菌聚为一支，具有较高的置信度。另外在弧菌属中，danJ基因是一种编码热休克蛋白40的管家基因，与reca、rpoa等持家基因比较，序列保守性更低，可作为弧菌鉴别的新工具。该研究采用Nhung等[4]建立的基于dnaJ基因的致病性弧菌检测方法，得到预期144 bp的碱基片段，进一步证实菌株150803为溶藻弧菌。

对于鱼类细菌病的治疗，生产上常用的方法是使用抗生素。该研究采用药敏纸片法分析了所分离菌株对22种抗生素的敏感性，在所试的22种抗生素中，菌株150803对恩诺沙星、环丙沙星、庆大霉素(120 μg/disc)、菌必治敏感；仅恩诺沙星在国标渔药之列，对氟苯尼考、呋喃唑酮、氯霉素、苯唑青霉素等具有抗性，提示细菌抗性也在逐渐增强。鉴于溶藻弧菌主要感染半滑舌鳎肠道，病程相对较长，且鱼类肠道本身也具有一定的免疫功能，因此生产上对于这一病原应以预防为主，半滑舌鳎为工厂化养殖，降低养殖密度，定期维护循环水设备，定期监测水质及水体中弧菌总数变化，保证充足溶氧，同时可在饲料中添加一定量的免疫增强剂提高鱼体抗病力，减少鱼体应激，这些措施均能够降低疾病的发生机率。

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IsolationandidentificationofpathogenresponsibleforthevibriosisinculturedCynoglossussemilaevisis

XU Xiao-li1, YE Hong-mei1, HOU Chun-qiang2, CAI Yan1, ZHONG Wen-hui1, LI He-mi1

(1. Tianjin Fishery Technical Extension Department, Tianjin 300221，China; 2. Tianjin Bohai Sea Fisheries Research Institute, Tianjin 300457,China)

Dominant bacteria designed as 150802 and 150803 were isolated from the internal of diseasedCynoglossussemilaevisisand the stain 150803 was proved to be highly pathogenic toC.semilaevisisby artificial challenge. The biological characteristics including morphological, physiological and bio-chemical characteristics were examined, and the hsp60 gene was sequenced and compared with the sequences deposited in GenBank databases. The results showed that the strain 150803 was Gram-negative bacilli. Based on the physiological and biochemical characteristic analysis, strain 150803 was identified asVibrioalginolyticus. Phylogenetic trees of Vibrio based on hsp60 gene indicated that strain 150803 showed the highest level of similarity toV.alginolyticusand the bootstrap was 99%. The expected 144 bp-nucleic acid fragment ofV.alginolyticusdnaJgene was amplified with the stain 150803 as a template. These results demonstrated that the vibriosis pathogen causing mortality inC.semilaevisiswasV.alginolyticus. Antimicrobial susceptibility assay showed that strain 150803 was susceptible to enrofloxacin, ciprofloxacin, gentamicinum and rocephin, but resistant to florfenicol, furazolidone, oxacillin, etc.

Cynoglossussemilaevis;Vibrioalginolyticus; hsp60 ;dnaJ

LI He-mi

S941.41+7

A

0529-6005(2017)08-0086-05

2017-03-28

天津市科委重大科技工程计划项目(14ZCDGNC00100);天津市水产局科研推广项目(J2016-03)

徐晓丽(1983-)，女，博士，从事水产动物病害与免疫工作，E-mail：1234xxl1234@163.com

李贺密，E-mail：scjstgz688@163.com