黄华春+曾绪东+孙长勇

【摘要】 目的 比较3种方法提取牙齿DNA的效果。方法 20具尸体的20颗磨牙， 将每颗牙磨成粉共60份， 分成A组、B组及C组， 每组20份。分别用M48纯化法、QIAcube纯化法和AutoMate Express纯化法对牙齿DNA进行提取， 比较3种方法提取牙齿DNA浓度水平、阳性内对照（IPC）荧光域值循环数（CT值）和短片段重复序列（STR）分型結果。结果 用M48纯化法、QIAcube纯化法和AutoMate Express纯化法提取牙齿DNA浓度水平分别为（5.24±2.81）、（5.66±2.33）、（8.23±3.54）ng/μl， AutoMate Express纯化法高于其他两种方法， 差异具有统计学意义（P<0.05）；上述3种方法提取牙齿DNA的IPC CT值分别为（27.16±0.28）、（26.96±0.36）、（27.12±0.22）， 差异无统计学意义（P>0.05）；M48纯化法、QIAcube纯化法和AutoMate Express纯化法3种方法STR基因座检出分型成功率分别为95%、95%和100%。结论 AutoMate Express纯化法对牙齿DNA的提取效果优于M48纯化法、QIAcube纯化法。

【关键词】 牙齿；M48纯化法；QIAcube纯化法；AutoMate Express纯化法

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.27.046

牙齿是DNA检验中的常见检材， 但牙齿的DNA提取是DNA检验的一大难点。牙齿DNA提取的研究已有不少文献报道[1-3]。本文通过比较M48纯化法、QIAcube纯化法和AutoMate Express纯化法提取牙齿DNA的效果， 以供同行参考。

1 材料与方法

1. 1 材料 牙齿样本来自实验室2015年4月～2016年11月

受理的检材。每具尸体1颗磨牙， 共20颗磨牙， 用刀片刮净牙齿表面， 浸泡在5%次氯酸钠溶液中5 min， 再用蒸馏水泡洗3次， 紫外灯照射6 h[4]。将每颗牙磨成粉， 称取200 mg为1份， 共3份， 分为A、B、C三组， 置于3个1.5 ml离心管， 60份牙粉分别标记为A1、A2……A20；B1、B2……B20；C1、C2……C20。同时提取尸体的肋软骨作为对照物。

1. 2 方法

1. 2. 1 DNA提取

1. 2. 1. 1 M48纯化法 A组牙粉加入MagAttract DNA Mini M48 Kit试剂盒G2 250 μl、蛋白酶（P）K（20 mg/ml）20 μl及二硫苏糖醇（DTT）（1 mol/L）20 μl， 56℃裂解6 h， 离心后加入MTL 750 μl及30 μl硅珠， 吸附15 min后弃液体， 80%乙醇洗涤3次， 置65℃烘干， 洗脱体积50 μl。

1. 2. 1. 2 QIAcube纯化法 B组牙粉加入QIAamp DNA Investigator试剂盒ATL 300 μl、PK（20 mg/m1）20 μl及DTT （1 mol/L） 20 μl， 56℃裂解6 h后置QIAcube核酸纯化仪提取DNA， 洗脱体积50 μl。

1. 2. 1. 3 AutoMate Express纯化法 C组牙粉加入PrepFiler Express BTA DNA试剂盒的裂解液300 μl、PK（20 mg/ml）

20 μl及DTT （1 mol/L） 20 μl， 56℃裂解6 h后置AutoMate Express DNA提取系统提取DNA， 洗脱体积50 μl。

1. 2. 2 DNA定量 采用Quantifiler Human DNA Quantification试剂盒， 用ABI 7500定量PCR仪对提取的样本DNA浓度进行定量， 按试剂盒说明书进行操作。

1. 2. 3 PCR扩增与检测 采用Identifiler plus试剂盒进行复核扩增， 反应体系10 μl， 模板DNA 1 μl， 循环29次， 扩增产物用3130XL遗传分析仪检测， GeneMapper ID 3.2分析， 相对荧光单位（RFU）的阈值为50， 以获得性别及12个以上STR基因座明确分型判为成功分型[5]。

1. 3 观察指标 观察3种方法提取DNA浓度水平、IPC CT值及STR基因座检出分型成功情况。

1. 4 统计学方法 采用SPSS16.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 多组间比较采用ANOVA方差分析， 两两比较采用LSD法。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2. 1 3种方法提取牙齿的DNA浓度水平和IPC CT值比较 采用AutoMate Express纯化法提取的牙齿DNA浓度水平高于M48纯化法、QIAcube纯化法， 差异有统计学意义（P<0.05）；QIAcube纯化法与M48纯化法比较差异无统计学意义（P>0.05）。采用上述3种方法提取牙齿的IPC CT值均在

27左右， QIAcube纯化法的IPC CT值最低， 但3种方法比较差异无统计学意义（ P>0.05）。见表1。

2. 2 3种方法STR基因座检出分型成功率 3种方法提取牙齿DNA扩增后检测， 与肋软骨检出的DNA分型进行比较， AutoMate Express纯化法提取牙齿的分型成功率为100%， M48纯化法和QIAcube纯化法均为95%。见表2。

3 讨论

目前， 牙齿DNA的提取方法有很多， M48纯化法、QIAcube纯化法和AutoMate Express纯化法是常用的牙齿DNA提取方法， 3种方法提取DNA的原理有所不同。M48纯化法是一种硅珠法， 在高盐浓度下DNA特异性吸附到二氧化硅上。QIAcube纯化法是一种硅膜法， 离心柱上硅胶膜能特异性结合DNA。AutoMate Express纯化法是一种磁珠法， 在高浓度盐的条件下， 磁珠能特异性吸附DNA。endprint

本文通过对牙齿样本用M48纯化法、QIAcube纯化法和AutoMate Express纯化法提取牙齿DNA， 结果表明， AutoMate Express纯化法获得的DNA浓度水平最高， 显著高于另外2种方法。本研究检出的牙齿DNA浓度水平比其他的研究者[1-3]

检出的都明显增高， 究其原因应该是所检牙齿都是在死后

2个月内尸体上提取的， 牙齿较为新鲜， 牙齿质量好。3种方法提取的牙齿DNA相同条件扩增和检测后显示， AutoMate Express纯化法的STR分型成功率达到了100%， 高于M48纯化法、QIAcube纯化法。从牙齿DNA浓度水平和STR分型成功率比较， AutoMate Express纯化法对牙齿DNA的提取效果优于M48纯化法、QIAcube纯化法， 原因可能是PrepFiler Express BTA DNA试剂盒的磁珠是一种纳米级磁珠， 平均粒径小， 分散性好， 不容易聚团和贴壁， 单位体积中的磁珠具有更大的用于吸附DNA的表面积， 吸附DNA能力更强[6]。

Quantifiler Human DNA Quantification试剂盒中， IPC与模板DNA同步扩增， 荧光定量PCR技术能判断模板中是否存在影响PCR的抑制物， IPC CT值的高低能够反映抑制物量的多少[7-10]。本研究结果显示， 3种方法提取牙齿DNA模板的抑制物均较少， IPC CT值均在27左右， 其中QIAcube纯化法的IPC CT值最低， 但3种方法间比较差异无统计学意义（P>0.05）。QIAcube纯化法在清除抑制物的能力稍优于另外

2种方法， 分析其原因可能是与硅胶模有关， 硅胶模的孔径能有效的滤去大颗粒杂质、小片段DNA和其他抑制成分。

综上所述， M48纯化法、QIAcube纯化法和AutoMate Express纯化法中的AutoMate Express纯化法提取牙齿DNA效果最好， 提取牙齿DNA能免脱钙， 裂解时间短， 又能实现自动化提取， 在实际检案中可以作为优选方案。

参考文献

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[10] 宋玉成， 邱波. 几种不同前处理方法提取的牙齿DNA浓度的对比. 法制博览， 2017（3）：212.

[收稿日期：2017-04-20]endprint