熊俊逸， 胡 姣， 夏 骊， 庞代文， 张志凌

(生物医学分析化学教育部重点实验室，武汉大学化学与分子科学学院，湖北武汉 430072)

1976年，埃博拉病毒首次在苏丹出现，患者出现出血热症状，引发腹泻、呕吐、胸痛、喉咙疼、皮疹[1]，致死率高达90%[2 - 3]。2014～2016年，埃博拉病毒在西非蔓延，据国际卫生组织报道，28 646人受到感染，11 323人不治身亡[4]。埃博拉病毒含有7种结构蛋白，分别是跨膜糖蛋白(GP)、核蛋白(NP)、RNA聚合酶(L)和4种病毒结构蛋白(VP)。其中，糖蛋白位于病毒和感染的细胞表面，参与病毒通过受体介导和膜融合进入宿主细胞的过程[5]。目前，埃博拉病毒的检测方法主要有酶联免疫吸附法(ELISA)[6]、荧光免疫法(FIA)[7]、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)[8]、电化学传感法[9]等。ELISA法具有操作简单、仪器简便的特点，通过检测核蛋白、糖蛋白、IgG、IgM来诊断埃博拉疾病[10]。而比色法，甚至目视比色法，可提供简便、快捷的检测手段[11 - 12]，有利于埃博拉病毒的现场检测。

免疫磁球具有便于操控、高比表面积等特点，可从复杂的基质中分离和富集低浓度的目标物，从而实现复杂样品中稀有组分的高灵敏检测[13]。因此，本文采用免疫磁球捕获和富集埃博拉病毒糖蛋白，通过比色信号对埃博拉病毒进行检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

TE2000-U 型荧光倒置显微镜(日本，Nikon 公司)；UV-2550 型紫外-可见分光光度计(日本，Shimadzu 公司)；RF-5301PC 型荧光分光光度计(日本，Shimadzu 公司)；Synergy 超纯水系统(美国，Millipore 公司)。

Tween 20、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)均购于Sigma Aldrich。MES(C6H13NO4S·H2O)购于Aladdin试剂公司。生物素化试剂Sulfo-NHS-LC-Biotin、1-step Ultra TMB、Dynabeads M-270羧基功能化磁球(2.8 μm，30 mg/mL)，均购于Thermo Fisher。脱脂奶粉购于Becton Dickinson公司。胎牛血清(FBS)购于PAN biotech。脱盐柱NAP-5购于GE healthcare。Alexa Fluor 488标记山羊抗马IgG(H+L)(AF 488-IgG，1.4 mg/mL)购于Jackson ImmunoResearch。埃博拉病毒糖蛋白(GP，1.8 mg/mL)和马源抗埃博拉病毒糖蛋白的单克隆抗体(mAb，12 mg/mL)均由中国科学院武汉病毒研究所提供。Femto-TBST(10×)、辣根过氧化物酶标记链霉亲和素(SA-HRP，0.5 mg/mL)均购于生工生物工程股份有限公司。NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O、NaOH均购于中国医药集团化学试剂有限公司。实验所用水均为超纯水。

1.2 免疫磁球的制备与表征

1.2.1免疫磁球的制备取100 μL M-270 羧基磁球，用100 μL MES(25 mmol/L,pH=5.0)洗涤两次；然后将磁球分散到含有25 mg/mL EDC和25 mg/mL NHS的100 μmol/L MES(25 mmol/L,pH=5.0)溶液中，200 r/min 37 ℃摇床孵育30 min后，用100 μL 0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH=7.2)洗涤3次，分散到100 μL含有60 μg 抗体mAb的PBS中，摇床孵育4 h。用PBS洗涤3次，分散到100 μL含有1%BSA的PBS中，摇床孵育1 h。最后将磁球用PBS洗涤3次，分散到100 μL中，4 ℃储存备用。

1.2.2免疫磁球的免疫荧光取1 μL免疫磁球(并以羧基磁球做对照组)，分散到 200 μL 0.01 mol/L的PBS(pH=7.2)中，加入1 μL AF 488-IgG，摇床孵育1 h。用PBS洗涤5次，得到磁球AF 488-IgG -MB，滴一滴到显微镜载玻片上，在荧光倒置显微镜的20×和100×物镜下观察。

1.2.3免疫磁球表面修饰抗体个数的测定将30 mg/mL羧基磁球分别稀释125、143、167、200、250、333、500、1 000倍，分别测定其在600 nm处的吸光度，以磁球浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。然后测AF 488-IgG -MB在600 nm处的吸光度，计算免疫磁球的浓度。

将羧基磁球稀释到相当于AF 488-IgG -MB的浓度，依次加入不同量的AF 488-IgG，用荧光分光光度计测其荧光强度(激发波长/发射波长：493/519 nm)，以AF 488-IgG的浓度为横坐标，519 nm处的荧光强度为纵坐标绘制标准曲线。然后测AF 488-IgG -MB的荧光强度，由绘制的标准曲线和免疫磁球浓度计算每个磁球表面偶联的抗体个数。

1.3 生物素化抗体的制备

取5 μL抗体mAb(约60 μg)用0.01 mol/L的PBS(pH=7.2)稀释到100 μL，然后加入15.6 μL 1 mg/mL新配的生物素化试剂Sulfo-NHS-LC-Biotin，在200 r/min的37 ℃摇床孵育2 h后，用脱盐柱纯化，根据280 nm处的吸光度，确定生物素化抗体的浓度。

1.4 基于免疫磁球比色检测埃博拉病毒糖蛋白的原理及步骤

图1 埃博拉病毒糖蛋白检测原理Fig.1 Schematic illustration of Ebola glycoprotein immunoassay process

基于免疫磁球比色检测埃博拉病毒糖蛋白的原理如图1所示。首先免疫磁球捕获样品中的埃博拉糖蛋白，然后与生物素化的抗体形成免疫夹心复合物，再通过生物素和链霉亲和素的特异性结合将辣根过氧化酶标记到免疫夹心复合物上。辣根过氧化物酶催化3，3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)产生颜色变化，通过比色和紫外-可见分光光度计实现对埃博拉病毒糖蛋白的定性和定量检测。

取2 μL免疫磁球，加入到100 μL的含有不同浓度埃博拉病毒糖蛋白的溶液中，在200 r/min的37 ℃摇床孵育1 h。用含0.1%的脱脂奶粉和0.05%的Tween 20的PBS(0.01 mol/L，pH=7.2)洗液洗涤3次，再分散到100 μL含有1 μg/mL生物素化抗体的孵育液(含0.3%脱脂奶粉和0.05%Tween 20的0.01 mol/L的PBS)(pH=7.2)中，摇床孵育1 h。用洗液洗涤3次，再分散到100 μL含有10 ng/mL SA-HRP和1%BSA的1×TBST中，摇床孵育1 h。用洗液洗涤5次，然后分散到100 μL TMB溶液中，孵育1 h。使用磁力架吸住磁球，取上清液用紫外-可见分光光度计进行测定。

2 结果与讨论

图2 (A)和(B)为免疫磁球在荧光显微镜20×物镜下明场和荧光场图；(C)和(D)为免疫磁球在荧光显微镜100×物镜下的视图；(E)～(H)为羧基磁球的荧光显微镜图Fig.2 (A) and (B) Bright and fluorescence field images of immunomagnetic microspheres under 20× objective of fluorescence microscope;(C) and (D) images under 100× objective;(E)-(H) images of carboxylic acid functioned magnetic microspheres

2.1 免疫磁球的表征

我们采用免疫荧光方法对磁球偶联抗体进行了表征。图2表明偶联抗体后的免疫磁球可以与AF-488标记的二抗结合产生荧光，而对照组的羧基磁球无荧光，说明抗体成功修饰到免疫磁球上。

为了表征免疫磁球表面偶联抗体的个数，我们用AF-488标记的二抗与免疫磁球表面的抗体结合，借助AF-488的荧光对磁球上偶联的抗体数量进行测定。

磁球在600 nm处吸光度与磁球的浓度有线性关系(图3)，测量AF 488-IgG -MB在600 nm处的吸光度，可以计算出磁球浓度。由于磁球的散射和吸收会对AF-488的荧光产生干扰，在AF 488-IgG -MB等量的磁球溶液中，依次加入不同量的AF 488-IgG，溶液在519 nm处的荧光强度与AF 488-IgG有线性关系(图4)，测量AF 488-IgG -MB的荧光强度可以推算出每个磁球上的抗体个数。经过计算，每个磁球平均偶联有6.6×104个抗体。

2.2 检测条件优化及对照性实验

我们通过三水平三因素的L9实验来优化100 μL体系中免疫磁球(IMMS)、生物素化抗体(biotin-Ab)、辣根过氧化物酶标记链霉亲和素(SA-HRP)的用量，分别是0.6 mg/mL、1 μg/mL、10 ng/mL。

为了验证埃博拉病毒糖蛋白检测原理的可靠性，我们进行了对照实验(图5)，4组对照组分别为羧基磁球(磁球未修饰抗体)、空白(未加入待测物)、缺少生物素化抗体(biotin-Ab)和缺少辣根过氧化物酶标记链霉亲和素(SA-HRP)。羧基磁球由于表面未封闭产生少量非特异性吸附(A370=0.259±0.052)，其它对照组均未见明显的紫外吸收(A370<0.1)，仅有阳性样品(50 ng/mL埃博拉糖蛋白)在370 nm处有明显的吸收(A370=2.692±0.241)。

图3 磁球在600 nm处紫外吸收值与其浓度的线性关系Fig.3 Absorbance intensity at 600 nm vs. the concentration of magnetic microspheres

图4 含0.1 mg/mL磁球的0.01 mol/L PBS(pH=7.2)中AF 488-IgG的浓度与荧光强度的线性曲线Fig.4 Calibration curve of the fluorescence intensity of AF 488-IgG at different concentrations in the presence of 0.1 mg/mL microspheres in 0.01 mol/L PBS(pH=7.2,200 μL)

图5 (A)50 ng/mL埃博拉病毒糖蛋白和对照组(羧基磁球、空白、缺少生物素化抗体、缺少SA-HRP)检测的紫外光谱图；(B)柱状图(插图：埃博拉病毒糖蛋白检测原理)Fig.5 (A) Absorption spectra for the positive (50 ng/mL) and controls (carboxylic acid magnetic beads，blank，absence of biotin-Ab，absence of SA-HRP ) of Ebola glycoprotein detection;(B) Histogram for above detection(Inset:schematic illustration of Ebola glycoprotein detection)

2.3 方法的分析性能

2.3.1线性范围和检测限在优化条件下，我们分析了基于免疫磁球的比色检测法对于不同浓度埃博拉病毒糖蛋白的响应(图6)。结果表明：溶液颜色和370 nm处的吸光度随着病毒糖蛋白浓度的增加而加深和增大，检测信号与1.0～25.0 ng/mL的病毒糖蛋白呈现线性关系(R2=0.985)，检测限为0.18 ng/mL，并且具有较好的重现性(变异系数CV=3.3%～15.5%)。

图6 (A)不同浓度埃博拉病毒糖蛋白颜色变化；(B)紫外光谱图；(C)370 nm的吸光度与病毒糖蛋白浓度的关系；(D)工作曲线Fig.6 (A) Photograph of the color change for Ebola glycoprotein at different concentrations and (B) UV absorption spectra(0,1,2.5,5,10,15,25,50 ng/mL);(C) Ebola glycoprotein concentration versus absorbance at 370 nm;(D) Calibration curve of Ebola glycoprotein in the range of 1.0-25.0 ng/mLError bars represent the standard deviation of triple measurements.

2.3.2特异性为了考察该方法的特异性，我们采用H7N9和H9N2禽流感病毒作为对照样品进行了检测。如图7所示，仅埃博拉糖蛋白有明显的吸收，而其它病毒均只有很弱的比色信号，因此该方法具有较好的特异性。

2.3.3复杂样品中的检测为了考察该检测方法的抗干扰能力，我们将埃博拉病毒糖蛋白加入到纯牛奶(超市购买)和胎牛血清(FBS)中，并进行基于免疫磁球的比色检测，阳性均表现出强的检测信号，而阴性的检测信号很弱(图8)，在牛奶和血清中依然具有很高的信噪比。

图7 埃博拉病毒糖蛋白检测的特异性(H7N9和H9N2作为阴性样品);插图：紫外吸收光谱图Fig.7 Histogram for the specificity of this method by using Ebola glycoprotein as positive sample and H7N9，H9N2 as negative samples;Inset:UV absorption spectra for these samples

图8 不同介质中埃博拉病毒糖蛋白阳性和阴性的比色检测结果Fig.8 Responses of absorption at 370 nm in the presence and absence of Ebola glycoprotein in different media

3 结论

本文构建了基于免疫磁球的埃博拉病毒糖蛋白的比色检测方法。吸光度信号与埃博拉病毒糖蛋白在1.0～25.0 ng/mL呈良好线性关系，检出限达0.18 ng/mL，方法重现性较好，特异性好，抗干扰能力强。