权宁海， 康英锦， 李东浩， 商海波

(长白山生物资源与功能分子教育部重点实验室(延边大学),延边大学理学院化学系，吉林延吉 133002)

1 引言

高通量筛选技术是以含有分子(如酶、受体)和细胞的微孔板为载体，从大量药物样品中筛选出与靶点有相互作用的候选药物的一种方法，即通过观察药物样品对靶点的生物活性或整体细胞的影响，筛选候选药物[1]。随着高通量筛选技术的不断发展，该技术已经成为发现新药物的重要途径[2]。中国传统的中草药是探索和发展新药物的丰富来源[3]。据记载，直到2010年为止，中国已经记录了大约有12 807种天然来源的药材，其中11 146种是植物来源，1 581种是从动物中提取的，还有80种来自矿物[4]。因此，具有微量、高效、大批量筛选等优点的高通量筛选技术，已经越来越多地应用于中草药中活性成分的筛选领域[5 - 6]。具体筛选通常使用标准的96孔、384孔、1 536孔等微量滴定板，在短时间内筛选大批量样品。尽管高通量筛选技术已经成功应用于中草药活性成分的筛选，但是由于中草药基质的复杂性、活性成分的分离、净化等繁琐的样品前处理过程，筛选中草药中的活性成分仍然是一项挑战性工作[7]。

2 高通量筛选技术

目前，高通量筛选技术分为分子水平和细胞水平的筛选。它们都是以靶点与活性成分相互作用的原理为基础而建立的微型体外高通量筛选模型。分子水平主要包括基于酶、受体、离子通道等的高通量筛选模型，它是通过检测经药物样品处理后靶点的活性而筛选靶点抑制剂的一种方法。细胞水平则是基于整体细胞的高通量筛选模型，是根据药物样品对整体细胞的影响筛选候选药物的一种方法。近年来，以上微型体外高通量筛选模型逐渐应用于中草药中活性成分的筛选领域。本文汇总了分子水平和细胞水平高通量筛选技术在中草药的应用实例(表1)。

2.1 分子水平模型

2.1.1基于酶的高通量筛选技术对于目前的多种疾病，通过中断细胞内错综复杂的酶途径，可能会实现有效的疾病治疗。据报道，大部分药物的作用靶点中，酶占20%以上，例如重组人Rho激酶、脂肪酶、α-葡萄糖苷酶、糜酶2、乙酰胆碱酯酶等。因此，有效发现酶抑制剂是新药研发的主要来源[7]。基于酶的高通量筛选模型是通过检测酶的反应底物或酶反应后产物的含量来筛选出酶抑制剂的方法。当活性成分与酶作用时，活性成分将激活或抑制酶的活性，从而影响酶水解产物的含量。宫丽丽等[8]建立了基于荧光素酶发光法的重组人Rho激酶高通量筛选模型。将重组人Rho激酶、待测样品、底物、ATP加入到384孔板中孵育，之后加入Kinase-Glo试剂，用荧光素酶发光法测定经过化合物或中药提取物处理后的酶活性。从3万个化合物和中药提取物中筛选出对重组人Rho激酶有作用的4个化合物和5个中药提取物。孙晓丽等[9]选用脂肪酶或α-葡萄糖苷酶为靶点，建立了基于脂肪酶、α-葡萄糖苷酶的高通量筛选模型。将中药提取物、脂肪酶、4-甲基伞形酮酯(4-Methylumbelliferyl oleate)加入96孔板中进行反应，通过测定反应产物4-甲基伞形酮的荧光吸收值，判断中草药提取物对脂肪酶活性的影响。而α-葡萄糖苷酶通过与底物对-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)反应所生成水解产物的紫外吸收情况，计算水解产物的含量，最终判断中草药提取物对α-葡萄糖苷酶活性的影响。从63种中药提取物中筛选出同时对脂肪酶和α-葡萄糖苷酶有抑制作用的5种中药提取物，分别为荷叶、姜黄、荜茇、桑枝、桑白皮。上述中药提取物对脂肪酶的Ic50值分别为28.00±5.51 mg·L-1、5.24 ±0.51 mg·L-1、14.76±2.58 mg·L-1、4.78±0.58 mg·L-1、3.41±0.67mg·L-1。而对α-葡萄糖苷酶的Ic50值分别为1.98±0.13 g·L-1、0.18±0.007 g·L-1、0.71±0.08 g·L-1、0.077±0.005 g·L-1、0.089±0.006 g·L-1。

表1 各靶点与中草药潜在抑制剂汇总表

许芹永等[10]从72种药食两用的中药中筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂，发现大部分中药提取物对α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制作用。在中药提取物反应浓度为0.625 mg·mL-1时，16种中药提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制效果达到100%。Luo等[11]建立了基于高效液相色谱的α-葡萄糖苷酶抑制剂高通量筛选模型。以α-葡萄糖苷酶为靶点，通过检测酶的反应产物4-硝基酚的含量，从中草药川西獐牙菜萃取液中筛选出了对α-葡萄糖苷酶具有最佳抑制作用的山酮素。王守宝等[12]基于重组仓鼠糜酶2建立了荧光方法测定酶活性的体外高通量筛选模型。由于底物(N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-7-amido-4-methylcoumarin)在糜酶2 作用下水解生成具有荧光的水解产物(7-amido-4-methylcoumarin)，因此通过该方法测定经中药作用后糜酶2的活性，从28 060种化合物和12 020种天然物萃取液中筛选仓鼠糜酶2的抑制剂。经过初筛，筛选出抑制率大于90%的样品，最终筛选出Ic50值分别为0.823 μmol·L-1和0.690 μmol·L-1的2种具有较强抑制活性的化合物。周思多等[13]建立了基于乙酰胆碱酯酶的高通量筛选模型。乙酰胆碱酯酶能够分解碘化硫代乙酰胆碱生成硫代胆碱，再将硫代胆碱与显色剂DTNB作用，检测生成物在405 nm处的光吸收情况，发现48种不同溶剂中药提取物中黄柏的乙醇提取物，元胡的乙醇提取物和丹参的乙酸乙酯提取物浓度在76.92 mg·L-1时，上述3种提取物的Ic50值分别达到259.12 mg·L-1、229.09 mg·L-1、1 202.26 mg·L-1。

2.1.2基于受体的高通量筛选技术受体是细胞膜或细胞内存在的蛋白质，它通过细胞外配基的结合，使细胞内产生信号并引起细胞内不同的生理效应。受体的过表达或突变导致的信号传递紊乱与多种癌症发生息息相关。因此，有效筛选受体抑制剂或激动剂至关重要。基于受体的高通量筛选技术是根据配体直接作用于受体后检测对受体的影响而进行的筛选。基于受体的高通量筛选技术分为直接筛选和间接筛选。直接筛选方法是通过检测配基与受体的相互作用而筛选的方法，但是此方法不能确定配基为激动剂还是拮抗剂。间接筛选方法则是通过检测配基与受体结合后细胞生物效应的变化而筛选的方法，此方法能够明确确定配基为激动剂还是拮抗剂。

邓小红等[14]开发了以多巴胺D5受体为靶点的细胞模型高通量筛选，从天然产物中筛选该受体的潜在激动剂。首先将多巴胺D5受体和报告基因同时转染HEK293细胞，G418筛选后，最终的单克隆细胞系用于多巴胺D5受体的激动剂高通量筛选，成功地从200多种天然产物中筛选出3种潜在的激动剂。胡毅翔等[15]以TAS2R14受体为靶点，构建了细胞模型高通量筛选。首先将携带绿色荧光蛋白GFP的慢病毒载体-TAS2R14基因转染HEK293T细胞，收集高滴度的慢病毒浓缩液和感染的HEK293T细胞，建立高度表达特异性TAS2R14受体的细胞模型，筛选120种中草药提取物和化学单体，并成功地筛选出了具有激动作用的天然抗哮喘中药单体。张庆等[16]以G蛋白偶联受体84(GPR84)即中链脂肪酸敏感受体为靶点，构建了细胞模型高通量筛选。首先将质粒基因GPR84和Gα1转染HEK293细胞，用抗生素进行筛选后，通过RT-PCR、免疫荧光染色和cAMP分析等方法得到稳定表达GPR84的细胞株，用于高通量筛选GPR84拮抗剂中。曹婧等[17]以组胺H3受体(H3R)为靶点，构建了激活剂的细胞模型高通量筛选。首先将H3R和报告基因的质粒共同转染HEK293细胞，构建稳定表达H3R的细胞株，激活剂结合于H3R，诱导细胞内信号通路，调节报告基因的表达，通过测定报告基因的表达水平，测定激活剂对H3R的影响。利用此细胞模型成功地筛选出与H3R结合的中药组分。

2.1.3基于离子通道的高通量筛选技术离子通道是一类可以调节细胞内离子水平的大分子膜蛋白。离子通道参与各种基本的生理过程，其故障导致很多人类疾病。因此，离子通道是一种重要的药理分析靶点。离子通道的高通量筛选方法包括配体结合分析、通量基础检测、荧光基础检测、自动电生理分析等[18](图1)。不同离子通道的高通量筛选方法都不同。囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)是上皮氯通道，Luan等[19]将CFTR和卤素传感绿色荧光蛋白YFP-H148Q共同表达在甲状腺上皮细胞上，通过通量基础检测，对34 000种TCM萃取液进行了筛选，并通过生物活性分析和核磁共振实验发现冬凌草中的贝壳杉烷型二萜-冬凌草甲素Oridonin对CFTR具有潜在抑制作用。Zhang等[20]基于CFTR介导的碘离子流入分析，建立了CFTR离子通道的高通量筛选模型。首先将CFTR和卤素传感绿色荧光蛋白EYFP-H148Q基因转染到FRT细胞上，将转然后的FRT细胞与中药提取物进行孵化，最终进行荧光检测。对500种中草药进行了筛选，发现中国野生葡萄藤中的白藜芦醇二聚体和白藜芦醇四聚体对CFTR氯离子通道具有抑制作用。Ic50值均达到0.02 mmol·L-1。同上原理， Chen等[21]建立了CFTR离子通道的高通量筛选模型，从传统中药中筛选出对CFTR氯离子通道具有抑制作用的表没食子儿茶素没食子酸酯和表儿茶素没食子酸酯。

图1 KCNQ2通道的激活剂的高通量筛选流程图。利用荧光铊通量测定法初筛，其次用384孔IonWorks Barracuda法确认先导化合物，验证后用传统的膜片钳实验来表征探针[32]。Fig.1 Flow-chart of the high-throughput screening route for identifying KCNQ2 activators.The fluorescence-based thallium flux assay was used for the primary screen,followed by the confirmatory 384-well IonWorks Barracuda for hit validation.After the hit validation,a conventional patch-clamp experiment was used for probe characterization[32].

2.2 细胞水平模型

细胞水平高通量筛选模型是通过观察整体细胞活性的变化，筛选影响细胞活性的药物(图2)。不同于分子水平模型，细胞水平高通量筛选模型可以用于难以分离的蛋白质和研究不够充分的靶点。Zhou等[22]以H9c2心肌细胞为靶点，建立了一种适用于筛选心肌细胞保护剂的高通量筛选模型，采用细胞计数试剂盒法，初步筛选出了可以提高受损心肌细胞活性的17种中草药。经过进一步验证，从中筛选出了2种心肌细胞保护剂。Gong等[23]建立了一种自然杀伤细胞与肺癌细胞和天然产物共培养的高通量筛选模型。根据分析不同天然产物对IFN-γ分泌程度的影响和肺癌细胞的存活率，从502个天然产物进行筛选，鉴定出28个候选天然产物，通过进一步证实，分析出具有潜在活性的一种化合物，穿心莲内酯。杨秀颖等[24]以肝癌细胞和成纤维细胞为模板分子建立了MTT法检测细胞活性的高通量筛选模型。通过利用224种不同溶剂提取出554个中草药提取物，从中筛选出了具有特异性抗肿瘤作用的中草药提取物，最终确定防己乙醇提取物对人肝癌细胞和成纤维细胞Ic50值分别为8.27 mg·L-1和19.48 mg·L-1。

图2 基于靶细胞生物活性的筛选过程示意图[33]Fig.2.Schematic drawing of target cell-based bioactivity screening process.[33]

2.3 其他筛选模型

埃博拉病毒(EBOV)、拉沙病毒(LASV)、禽流感病毒(AIV)等的感染危害全球人类的健康，因此筛选有效的病毒抑制剂至关重要。Yang等[25]利用人免疫缺陷病毒的筛选手段，基于细胞模型高通量筛选，从不同中草药中筛选了对埃博拉病毒的天然抑制剂，其中草药包括栀子、酸橙、紫花地丁、夏枯草、薏苡mayuen变种罗马草、桑等，并提出它们具有潜在的抗埃博拉病毒活性。Garcia等[26]基于细胞水平高通量筛选模型，采用天然化合物和中药分子，利用慢病毒颗粒对HIV-1抑制剂进行了筛选，结果所筛选出的抑制剂属于非核苷逆转录酶抑制剂。Dai等[27]以A型流感病毒为靶点，利用高通量筛选平台从83种中药中筛选出35种药用植物，并根据已有的相关报告，发现矮丛越橘、欧洲葡萄、肉桂有一个共同活性化合物，原花青素，并发现原花青素能够通过生命周期的几个阶段抑制流感病毒的复制。

3 问题与展望

经数千年的历史记载，中草药作为一种宝贵且天然的资源，已被广泛应用于各种疾病的治疗并得到认可。许多治疗经验统计表明，通过中草药之间的配伍，可以得到更好的疗效，且毒副作用较少[28]。在许多中草药活性成分的筛选技术中，高通量筛选技术具有快速、简便等优势。并且，高通量筛选技术与目前先进的检测技术、计算机筛选技术、微流控芯片技术[29 - 31]等的有效结合，加速了中草药活性成分的筛选进程。但是，近年来“精准医学”概念的提出，筛选并研发靶点明确、疗效突出、安全高效、稳定可控的多靶点多组分天然药物已逐渐成为棘手问题。然而，高通量筛选技术在基质比较复杂的中草药中筛选有效成分的过程中，需要一系列复杂的样品前处理过程，导致天然药物研发周期较长的问题。并且，对于细胞水平的高通量筛选技术，其作用靶点仍不明确，靶点与有效成分作用比例也不明确。因此，在天然产物新药研发中筛选技术需要创新性突破，并在简便快速、精准有效等方面需要进一步得到发展和完善。