秦广利，肖文静

菌落总数传统与快速检测技术的比较探讨

秦广利，肖文静

（商丘市质量技术监督检验测试中心，河南商丘 476000）

采用对比分析法，将检测食品微生物菌落总数的传统国标法与现代快速检测法进行比较分析。在综述分析采用国标法检测注意事项的基础上，重点介绍现代快速检测的技术原理及特点，该方法具有速度快、检测项目全、准确性高等优点，在食品微生物菌落总数的检测中具有重要应用价值。

传统方法；快速方法；菌落总数

民以食为天，食以安为先。食品是人类赖以生存和发展的基本物质条件，食品安全涉及人类最基本的权利保障。随着经济的全球化，食品种类越来越丰富；随着食品加工过程中化学品和新技术的广泛使用，食品安全问题也越来越突出。三聚氰胺、瘦肉精、毒豆芽等事件频频曝光，严重危害消费者身体健康与生命安全，食品安全问题已成为消费者关注的焦点。为了保证食品安全，国家出台了《中华人民共和国食品卫生法》 《中华人民共和国农产品质量安全》等相关的法律与条例，科学合理的检测技术是确保食品安全的关键，运用先进的检测方法是保障检测数据准确性和可信度的保障。食品中菌落总数反映从原料加工到成品包装受外界污染情况，也能够衡量细菌在食品中的繁殖动态，确保食品的保质期，是食品安全卫生评价的重要指标[1-2]。将检测食品微生物菌落总数的传统国标法与现代快速检测法进行比较分析，对食品安全菌落总数的检测具有重要意义。

1 传统检测方法

1.1 传统检测方法的流程

传统检测方法的流程：

检样20 g/mL样品+225 mL稀释液，均质→10倍系列稀释→选择2～3个适宜稀释度的样品匀液各取1 mL，分别加入无菌培养皿内→每皿中加入15～20 mL平板计数琼脂培养基，混匀→培养→计数各平板菌落数→计算菌落总数→报告。

1.2 注意事项

国标法检验样品中微生物菌落总数是样品经过前处理后，平板接种到一定成分培养基上，在一定温度、时间、有氧等条件下培养后所得到每克或每毫升中形成的结果。该方法采用普通培养基，在温度为35～37℃的有氧条件下培养，所以检测的结果只包括了一些嗜中温、有氧的细菌菌落，对于一些有特殊营养要求厌氧菌受到了抑制，与样品中实际菌落总数存在差异。因此，采用国标法检测菌落总数应该注意以下几个问题。

1.2.1 玻璃器皿及稀释液

检测样品前先将检验过程所用到的玻璃器皿（如培养皿、微量移液管、锥形瓶等） 彻底清洗干净，然后用灭菌设备进行完全灭菌，保证没有任何残留菌或抑菌物质；制作样品稀释液时最好每批设空白对照组，防止在样品平板上若菌落出现较少，就要与对照平板进行比较，用于诊断是否是空白稀释液、平皿培养基、吸管等可能存在的污染。

1.2.2 样品稀释

检验样品稀释时，固体和半固体样品无菌称取25 g，放入装有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，转速控制在8 000～10 000 r/min均质1～2 min（因样品而定）。如果固体样品较大，先无菌剪碎再放；液体样品用无菌吸管吸取25 mL，放入装有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混合均匀，稀释成比例为1∶10样品液。如果液体样品酸度较高（比如碳酸性饮料类的食品），直接吸取原液进行检测，往往会出现结果偏低，甚至为0，可以先用25%左右的无菌碳酸钠将样品液的pH值调成中性，再严格按照标准进行检测才能降低结果误差[3]。

如果想继续递增稀释成1∶100的样品匀液，选择1 mL的无菌吸管或微量移液管吸取1∶10样品液1 mL，放入装有9 mL稀释液的无菌试管中，注意加入溶液时所使用的吸管或移液管尖端紧靠试管壁慢慢注入，切忌不要触及稀释液面，加入后轻轻振荡摇匀即可。

1.2.3 制作平皿接种与培养

平皿制作时要根据食品卫生标准要求对样品污染状况进行估计，选择适宜的2～3个稀释度样品匀液（液体样品可包括原液），分别进行10倍递增稀释时，用无菌吸管吸取1 mL样品匀液从皿侧加入，注意不要全部揭开皿盖，每个稀释度分别做2个平皿作为重复。同时，分别吸取空白稀释液1 mL加入2个无菌皿内作为样品液的对照。然后每个平皿分别加入15～20 mL平板计数琼脂培养基，温度控制在45～47 ℃。

平皿接种后，待琼脂凝固时将平板翻转开始培养，培养温度和时间根据食品样品种类确定。原因是不同食品在加工生产时温度及特性存在明显差异。肉、奶、蛋类食品培养温度35～37℃，培养时间47～49 h；水产品29～30℃培养70～74 h。具体每种食品培养温度与时间参照食品卫生标准。

1.2.4 菌落计数

培养到一定时间后，从温箱内取出平板开始菌落计数时，可以肉眼观察，也可以借助放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量，菌落计数单位以CFU表示。菌落选取的范围控制在30～300 CFU，无蔓延菌落生长的平板计数总数，少于30 CFU的平板可记录具体菌落数，多于300 CFU的平板可记录为多部可计。每个样品稀释度的菌落数，应该采用2个重复平板的平均数。

平板菌落诊断，每个稀释度2个重复平板，如果其中1个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该样品稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的50%，而其余50%中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表1个平板菌落数。当平板上出现菌落间无显著界线的链状生长时，则将每条单链条作为1个菌落计数。

1.2.5 结果与报告

菌落结果报告填写有6种情况：①如果在所设不同稀释度中只有1个稀释度平板的菌落数在适宜的范围内，将2个平板菌数的平均值乘以相对应稀释倍数作为报告的值；②若有2个稀释度平板菌落数平均值都在适宜范围内，应该根据2个稀释的平均值之比确定报告数，比值小于2，报告其平均值；③若所有稀释度的平板菌落数都大于300 CFU，结果按稀释最高的平板菌落数乘以最高稀释倍数报告；④若所有稀释度的平板数都小于30 CFU，结果按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告；⑤若所有稀释度的平板都无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告；⑥若所有稀释度的平板菌落数都不在30～300 CFU，其中一部分小于30 CFU，一部分大于300 CFU，则以接近30 CFU或300 CFU的平均菌落数乘以稀释倍数报告。

2 快速检测新技术

2.1 3M测试片快速分析技术

2.1.1 3M测试片快速分析技术概念

3M测试片法是一种便捷可再生水化干膜，适用于细菌和真菌的计数。

3M测试片效果见图1。

图1 3M测试片效果

2.1.2 检测步骤

3M测试片快速分析步骤见图2。

图2 3M测试片快速分析步骤

只需3步就可实现快速准确的测定。

2.1.3 结果判读

3M测试片快速分析结果见图3。

图3 3M测试片快速分析结果

①测试片中含有一种红色指示染剂可使菌落着色，计算所有红色菌落（不论其大小和颜色深浅均计算之）；②测试片上没有任何菌落生长；③测试片生长有不多的菌落；④测试片生长的菌落数在25～250个适宜范围内；⑤测试片生长菌落数超过250个，则选择观察1个或几个有代表性的小方格面积（1 cm2），求其平均数乘以测试片的总面积，获得总菌落数；⑥测试片上菌落太多而无法计数。

2.1.4 3M测试片技术特点

（1）提高工作效率。使用3M测试片快速分析食品中微生物菌落，与传统分析方法相比较，简化了检测程序，减少了样品分析成本，节省劳动资源，缩短了样品检测分析时间，能在更短的时间内获得样品分析的准确可靠结果，效益明显得到提高。大量研究分析数据统计，使用3M测试片技术可以显著提高样品检测工作效率。

（2）微生物菌落检测方法的标准化。传统的检测方法在培养基配制、样品接板、培养条件的控制等环节，不同的检测人员在操作上存在差异，造成检测结果有误差。3M测试片快速检测技术简化了传统检测方法的环节，解决了传统方法存在的问题及弊端，实现了微生物菌落检测技术的标准化。

（3）3M测试技术得到国际化的认证。3M测试技术在微生物菌落检测中得到广泛应用，同时也通过了AOAC，AFNOR在国际权威机构的认证，在世界其他国家也获得官方机构的批准，实现了全球化推广应用，得到了检测结果的可靠性和世界各地的广泛认可。

（4） 方便进行HACCP认证。3M测试技术由于检测速度快、检测项目全、准确性高的特性，为食品加工生产过程中关键控制点的监控提供了快速检测技术，实现了包括生产线、生产设备和环境在内的各个环节进行全面的测试。

2.2 ATP荧光法快速检测技术

2.2.1 技术原理

萤火虫会发光是由于它能合成将化学物质的化学能转变为光能的生物催化剂——荧光素酶、虫荧光素（D-luciferin），以及所有细胞生物都产生的生物能量物质——三磷酸腺苷（ATP）。

虫荧光素与三磷酸腺苷在催化剂荧光酶的作用下，发生有氧氧化反应。

化学反应式见图4。

图4 化学反应式

2.2.2 技术特点

ATP荧光法检测食品微生物总菌落数在国内外已被广泛推广应用，该方法具有成本低、操作简单、响应速度快等特点。

2.3 MTT法快速检测技术

2.3.1 技术原理

活体微生物细胞中线粒体含有琥珀酸脱氢酶，外源性MTT（噻唑蓝）在琥珀酸脱氢酶作用下被还原成不溶性的蓝紫色结晶甲臜（Formazan） 并沉积在细胞中，而死细胞不能发生此还原反应。甲臜（Formazan） 结晶形成的量与活菌数成正比。将酶联免疫检测仪的波长调控到490 nm处测定其吸光度，可间接反映活菌细胞数量。

巴氏消毒牛奶中活菌素快速检测流程见图5。

图5 巴氏消毒牛奶中活菌素快速检测流程

2.3.2 应用实例巴氏消毒奶中活菌素快速检测

巴氏消毒牛奶中活菌素快速检测结果见图6。

取巴氏消毒奶10 mL，置于无菌离心管中以转速3 000 r/min离心5 min，弃去上清液；加入10 mL无菌生理盐水洗涤离心管，再次3 000 r/min离心5 min，弃去上清取出奶液基质；加入1 mL生理盐水重悬底部的微生物，取0.2 mL到96孔酶标板中，同时加入标准菌液做标准曲线，统一加入底物反应30 min，读数。

图6 巴氏消毒牛奶中活菌素快速检测结果

该技术具有检测快速、灵敏度高等特点。

3 结语

食品中菌落总数反映了从原料加工到成品包装受外界污染情况，也能够衡量细菌在食品中的繁殖动态，确保食品的保质期，是食品安全卫生评价的重要指标。检测过程的每一个环节都要认真细心、精准操作，才能确保结果的准确度。传统检测最常用的方法是国标法采用的平板计数，操作过程复杂，完成检测时间较长，影响工作效率。而新的检测技术检测速度快、检测项目全、准确性高，但是存在成本相对较高，并且对检测食品的种类有特定的要求。因此，应该研究科学先进的检测技术，让检测更加精准、经济、便捷和可靠，确保食品卫生安全。

[1]黄伟伟.食品中菌落总数的国标法测定注意事项及快速检测技术 [J].台湾农业探索，2012（3）：56-59.

[2]卢崇南，刘毅，吴达勇.pH值对菌落总数检测结果的分析 [J]．国际医药卫生导报，2005（15）：121-122.

[3]王晓文，张俊伟.TTC应用于食品菌落总数测定的研究 [J]．辽宁大学学报，2011，38（1）：86-89.◇

The Discussion of the Analysis on the Comparison of Detection Technology between the Traditional and the Fast Method

QINGuangli，XIAOWenjing
（Shangqiu Quality Technology Supervision and Testing Center，Shangqiu，He'nan 476000，China）

In this paper，the comparative analysis method is used to the traditional national standard method and modern rapid detection method of testing the total number of bacterial colonies.On the basis of the review of the national standard method，the principle and characteristics of modern fast detection technology are introduced.The Examples prove that the method is fast，test items complete and high accuracy，and which is of great importance in the detection of microbial colony of food.

traditional methods；the fast method；the total number of colonies total number of colonies

TS207.4

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.09.018

1671-9646（2017） 09a-0064-03

2017-07-18

秦广利（1979— ），女，硕士，工程师，研究方向为微生物学。