孙玉林，陈锡堃，黄冠鹏，陈晶晶，陈 薇，张传耀，周 颖，陈道海

（1.岭南师范学院生命科学与技术学院，广东 湛江 524048；2.环北部湾海洋药用动物利用与保护研究所，广东 湛江 524048）

碱提拟目乌贼肌肉多糖工艺优化及抗氧化活性研究

孙玉林1，2，陈锡堃1，黄冠鹏1，陈晶晶1，陈 薇1，张传耀1，周 颖1，陈道海1，2

（1.岭南师范学院生命科学与技术学院，广东 湛江 524048；2.环北部湾海洋药用动物利用与保护研究所，广东 湛江 524048）

为研究碱提拟目乌贼肌肉多糖工艺优化，在探索提取温度、NaOH浓度及料液比单因素试验基础上，采用响应面法进行优化设计，得出最佳提取工艺为：提取温度90℃、NaOH浓度3%、料液比1∶28 g/mL，在此条件下，多糖提取率为0.68%。此外，对多糖抗氧化活性研究结果显示，多糖浓度为10 mg/mL时，对DPPH自由基的清除率为68%、其相应的IC50值为7.62 mg/mL；对·OH的清除率为45.72%，其相应IC50值为12.44 mg/mL，还原力大小为0.263。红外光谱显示该提取物具备一般多糖类物质的光谱特征。

拟目乌贼肌肉；提取；多糖；抗氧化活性；红外光谱

Abstract：To study the optimal alkaline extraction technology of Sepia lycidas muscle polysaccharides，the extraction temperature，NaOH concentration and ratio of raw material to water were optimized by response surface methodology design based on single-factor tests. The optimal extraction conditions were extraction temperature of 90℃，NaOH concentration of 3%，and ratio of raw material to water of 1∶28 g/mL，respectively.Under these conditions，the extraction yield of polysaccharides was 0.68%. In addition，the antioxidant activity of polysaccharides was evaluated. When the concentration was 10 mg/mL，the scavenging rate of DPPH was 68% with the IC50value of 7.62 mg/mL，and the scavenging ratio of·OH was 45.72% with the IC50value of 12.44 mg/mL.The value of reducing capacity was 0.263. Moreover，IR spectroscopic analysis showed the extract had the common spectroscopic characteristics of polysaccharides.

Key words：Sepia lycidas muscle；extraction；polysaccharides；antioxidant activity；IR spectrum

多糖（polysaccharide，PS）又称多聚糖，是一种由醛糖和（或）酮糖通过脱水形成糖苷键，并由糖苷键线性或者分枝连接组成的链状聚合物，具有多样的生物活性，如抗氧化、抗肿瘤、抗凝血、抗病毒、抗炎等［1］。随着人类对海洋药用生物资源研究开发的逐渐深入，海洋动植物多糖研究也日益增多，目前已从鲍鱼［1］、牡蛎［2］、四角蛤蜊［3］、瘤背石磺［4］、厚壳贻贝［5］、巴夫藻［6］分离出多种具有生物活性的多糖。

拟目乌贼（Sepia lycidas）属于软体动物门（Mollusca）、头足纲（Cephalopoda）、鞘亚纲（Coleoidea）、乌贼目（Sepiida）、乌贼科（Sepiidae）、乌贼属（Sepia），分布于印度洋、西太平洋海域，常栖息于水深15～100 m处［7］。乌贼的药用价值很高，乌贼墨有抗癌、抗辐射、止血等作用；乌贼骨（海螵蛸）有各种收敛作用，可治疗胃病等；乌贼肉和乌贼血有活血化瘀、滋阴等作用［8］，是一种营养价值和经济价值均较高的优良海产品品种［9］。目前，除对乌贼墨多糖和性腺多糖的抗氧化活性有少量报道外［10-12］，关于拟目乌贼肌肉碱提多糖工艺优化及抗氧化活性研究尚未见报道。本试验对碱提拟目乌贼肌肉粗多糖工艺进行优化，并对其体外抗氧化活性进行研究，考察其作为天然抗氧化剂的应用前景，以期为拟目乌贼肌肉多糖综合利用与开发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

拟目乌贼于湛江市水产批发市场（霞山）收集得到，随机挑选成体拟目乌贼10头，每头体重1.5（±0.5）kg，胴体长26（±4）cm，胴宽12（±4）cm。DPPH（AR），美国Sigma公司；三（羟甲基）氨基甲烷（BR），上海国药集团化学试剂有限公司；K3［Fe（CN）6］（AR），天津大茂化学试剂厂；30%过氧化氢（AR）、抗坏血酸（AR），上海穗试剂公司；三氯乙酸（AR）、焦性没食子酸（AR）、水杨酸（AR）、硫酸亚铁（AR）、甲醇（AR）、无水乙醇（AR），广州市金华大化学试剂有限公司；牛血清蛋白、苯酚、干酪素、酪蛋白、浓硫酸、磷酸氢二钠、葡萄糖、磷酸二氢钠、氢氧化钠、柠檬酸、氯化钠、考马斯亮蓝等均为国产分析纯，湛江康百医疗器械有限公司。

DS-1高速组织捣碎机，上海标本模型厂制造；UV-3000型紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司。LGJ-18冷冻干燥机，北京四环科学仪器厂生产；DFY-200手提式高速中药粉碎机，青州市三宝中药机械厂；PHS-3C pH计，上海天达仪器有限公司；AUX320电子天平，日本岛津公司；YN-Z0-Z-10全自动电热蒸馏水器，上海博迅实业有限公司；HHS电热恒温水浴锅，上海博迅实业有限公司；N-1100旋转蒸发仪，上海爱朗仪器有限公司；H/T18MM台式离心机，湖南赫西仪器装备有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 多糖制备 原料预处理：拟目乌贼解剖，去表皮、内脏，得乌贼肌肉，切碎，加适量蒸馏水用组织捣碎机打成匀浆状，采用丙酮脱脂3次，冷冻干燥，用中草药粉碎机粉碎得拟目乌贼肌肉冻干粉，密封保存在-20℃冰箱，备用。

1.2.2 碱提取法 设置提取温度为75、80、85、90、95℃，NaOH浓度为1%、2%、3%、4%、5%，料液比为 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL，每个处理3次重复。

根据Box-Benhnken的中心组和实验设计原理，在单因素试验基础上，以提取温度（A）、NaOH浓度（B）和料液比（C）为自变量进行优化组合，以多糖得率（Y）为指标，进行响应面实验设计，并利用软件Design expert 8.0.6对数据进行分析。试验设计因素及水平见表1。

表1 试验因素水平及编码

1.2.3 拟目乌贼多糖含量的测定方法 采用苯酚-硫酸法［13］，将葡萄糖在105℃干燥至恒重，然后配置成100 μg/mL标准溶液，取7支试管，每支试管分别移取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL标准溶液，再分别补水至2 mL，加入1 mL5.0%的苯酚溶液并混匀，快速加入5.0 mL浓硫酸摇匀，静置30 min，在490 nm处测定各管中溶液的吸光度值，空白对照为蒸馏水，3次重复，根据标准曲线计算多糖得率：

式中，R为多糖得率，%；C为待测液中多糖质量浓度，mg/mL；V为待测液体积，mL；N为稀释倍数；m为拟目乌贼肌肉干粉质量，g。

1.2.4 拟目乌贼多糖抗氧化活性测定 （1）清除DPPH自由基能力的测定。参照文献［14］取不同质量浓度的多糖溶液2 mL，将0.2 mmol/L DPPH的无水乙醇溶液2 mL加入并混匀，常温避光反应30 min，于517 nm波长处测定吸光度。阳性对照为VC，计算清除率：

式中，A0、A1和A2均为溶液的吸光度，分别对应2 mL双蒸水+2 mL DPPH、2 mL多糖溶液+2 mL DPPH、2 mL多糖溶液+2 mL无水乙醇。

（2）清除·OH自由基能力测定。参照文献［15］取不同浓度多糖溶液1 mL，将9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液1 mL、8.8 mmol/L H2O2溶液1 mL和9 mmol/L FeSO4溶液1 mL加入其中并混匀，37℃水浴30 min，3 000 r/min条件下离心10 min，510 nm波长处测定上清液的吸光度，阳性对照为VC，空白对照为双蒸水，计算清除率：

式中，A0、AX和A1分别为空白对照溶液、加入多糖溶液和以双蒸水代替H2O2溶液的吸光度。

（3）多糖还原力的测定。参照文献［16-17］用试管取1.0 mL样液，然后加入2.5 mL磷酸盐缓冲液（0.2 mol/L、pH6.6）和2.5 mL K3［Fe（CN）6］溶液（1%），混匀后在50℃水浴中反应20 min，迅速冷却并加入2.5 mL10%三氯乙酸，混匀后以4 000 r/min离心10 min。取2.5 mL上清液加入0.5 mL 0.1%三氯化铁溶液混匀，再加1 mL蒸馏水摇匀，以蒸馏水调零，室温反应10 min后700 nm处测定吸光值。以去离子水代替样品作为空白对照，3次重复。

1.2.5 红外光谱（IR）分析 取干燥后的样品2 mg，在玛瑙钵中与KBr粉末研磨均匀，并用压片机压成薄片，利用反射法在4 000～400 cm-1范围内，采用Nicolet 6700傅立叶红外光谱仪进行扫描。

采用Design expert 8.0.6软件对数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线的建立

通过苯酚硫酸法，测得葡萄糖标准曲线回归方程为：Y=0.0969x-0.0007，R2=0.9959。式中，X为葡萄糖含量（mg/mL），Y为吸光值。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 提取温度对多糖得率的影响 固定NaOH浓度3%，料液比1∶30 g/mL条件下，设置提取温度分别为 75、80、85、90、95℃，考察其对多糖得率的影响，结果见图1。如图1所示，提取温度由75℃升至90℃时，多糖得率不断增加；当温度继续升高时，多糖得率开始缓慢下降。原因可能是多糖的结构和活性受到高温影响，导致多糖降解，所以在本实验设定条件下，确定最适提取温度为90℃。

图1 提取温度对多糖得率的影响

2.2.2 NaOH浓度对多糖得率的影响 固定提取温度90℃、料液比1∶30 g/mL条件下，设置NaOH浓度分别为1%、2%、3%、4%、5%，考察其对多糖得率的影响，结果见图2。由图2可知，NaOH浓度在1%～3%范围时，多糖得率不断增加，当NaOH浓度超过3%时，多糖得率不断下降。原因可能是过高的碱液浓度导致多糖结构破坏，因此，从多糖得率的角度，选取NaOH浓度为3%。

图2 NaOH浓度对多糖得率的影响

2.2.3 料液比对多糖提取率的影响

固定提取温度90℃，NaOH浓度3%条件下，设置料液比 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL，考察料液比对多糖得率的影响，结果见图3。从图3可以看出，多糖得率随着溶剂用量的增加而逐渐增加。料液比在1∶30 g/mL前，多糖得率增加显著；料液比在1∶30 g/mL后，多糖得率增加缓慢。原因是当提取溶剂较少时，多糖黏度较大，不利于其溶解，多糖得率较低；当提取溶剂量增加时，多糖得到溶解充分，相同条件下其得率会升高；但当提取溶剂增加到一定量时，多糖已被最大化地提取出来了，因此其得率不再增加。过多提取溶剂导致后续浓缩、醇沉等步骤工作量大，最后将1∶30 g/mL确定为最佳料液比。

图3 料液比对多糖得率的影响

2.3 碱提工艺的响应面试验设计优化及结果

2.3.1 建立回归模型及检验显著性 以单因素实验为基础，对提取温度（A）、NaOH浓度（B）和料液比（C）3个因素，通过Box-Behnken设计响应面来优化多糖提取工艺，试验设计与结果见表2。二次回归模型和二次多元回归方程通过Design expert 8.0.6软件建立，结果如下：

Design Expert软件分析结果见表3，此模型P=0.0014＜0.01，说明此模型达到极显著水平。失拟项的P=0.1202＞0.05（不显著）及R2=0.9430，表明该模型对实验结果拟合程度较好，对实验点的适配度达到94.30%，因此，能够用该模型预测上述3个因素对多糖得率的影响，且误差较小。由于分析模型回归方程系数的P、A、B、C、A2、C2项的影响显著，AB、AC、BC、B2影响不显著，所以拟合方程消去不显著项后，简化为：

2.3.2 响应曲面和等高线图分析 等高线的形状，可以形象观察最佳参数以及各变量之间的相互作用，两被测变量间交互作用如果显著，则等高线呈椭圆形；反之，不显著的话，等高线呈圆形［18］。从图4 ～ 图6可以看出，3个图形的等高线均呈椭圆形，表明两被测变量间即提取温度和NaOH浓度、提取温度和料液比和NaOH浓度和料液比之间的交互作用均是显著的。

2.3.3 验证与优化 响应面分析后的最优提取条件为：提取温度90.91℃、NaOH浓度3.02%、料液比1∶27.87g/mL，此条件下，多糖理论得率为0.693%。根据上述条件进行3组验证试验，所得结果与预测值的偏差为1.88%（表4），偏差不大，结果稳定，表明该模型能很好地预测碱提拟目乌贼肌肉多糖的提取工艺。

表2 响应面试验设计及结果

表3 响应面模型的方差分析

图4 Z=f（A，B）的响应面和等值线

图5 Z=f（A，C）的响应面和等值线

图6 Z=f（B，C）的响应面和等值线

表4 优化工艺验证结果

2.4 拟目乌贼肌肉多糖体外抗氧化活性

2.4.1 多糖对DPPH自由基清除能力 由图7可知，多糖对DPPH自由基的清除作用明显，清除率随着多糖浓度的增加而逐渐增强，两者具有明显的量效关系。当多糖浓度为10 mg/mL时，对DPPH自由基的清除率为68%。VC浓度为0.4 mg/mL时对DPPH自由基的清除率可达73%，与VC相比，多糖的清除率相对较弱。

图7 多糖对DPPH自由基的清除作用

2.4.2 多糖对·OH自由基清除能力的测定 从图8可以看出，多糖对·OH自由基有清除作用，且清除率随着多糖浓度的增加而逐渐增强，呈现一定的正相关性。当多糖浓度为10 mg/mL时，其清除率为45.72%，而当VC浓度仅为0.3 mg/mL时，清除率可达46%。

图8 多糖对·OH自由基的清除作用

2.4.3 多糖还原力的测定 已有研究表明，还原力越大，抗氧化性越强［19］。从图9可以看出，在所选浓度范围内，多糖显示出一定的还原力，且还原力随浓度的增加而增强，当多糖浓度为10 mg/mL时，还原力为0.263，达到相同效果的VC浓度仅为0.04 mg/mL（还原力大小为0.241）。

图9 多糖的还原力

2.5 拟目乌贼肌肉多糖对·OH自由基和DPPH自由基半清除率浓度（IC50）比较

从表5可以看出，拟目乌贼肌肉多糖对DPPH自由基和·OH自由基的IC50值分别为7.62和12.44 mg/mL，均高于VC的IC50值（0.20、0.38 mg/mL）。拟目乌贼肌肉多糖对这2种自由基的半清除率浓度有差异，其中对DPPH自由基的半清除率浓度要低于·OH自由基，清除效果相对而言较好。

表5 拟目乌贼肌肉多糖对·OH自由基和DPPH自由基半清除率浓度（IC50）比较

2.6 多糖红外光谱分析

图10 多糖的红外谱图

由图10可知，在3 600～3 200 cm-1处，出现一个吸收较强的宽峰：3 420.16 cm-1，为-OH伸缩振动峰。在3 000～2 800 cm-1范围出现弱的吸收：2 959.35 cm-1，为C-H伸缩振动峰。在1 400～1 200 cm-1处存在C-H变角振动，为1 399.81 cm-1吸收峰。在1 200～1 000 cm-1处的吸收峰是由吡喃糖环的醚键（C-O-C）和-OH伸缩振动引起的，其吸收峰是1 168.68 cm-1，此四组吸收峰均是糖类物质的特征吸收峰［20］，说明本实验碱法获得的提取物为多糖类物质。另外，1 654.66 cm-1处分别有一强的吸收峰，为酰胺I带的吸收峰；1 558.26 cm-1是N-H的变角振动，为酰胺II带的吸收峰，证明该提取物中有少量与糖结合的蛋白（如糖蛋白）存在［21］。592.95 cm-1是 O-H 面外弯曲振动吸收峰［22］。

3 结论与讨论

采用碱法提取拟目乌贼肌肉多糖，在单因素实验基础上，采用响应面法优化提取工艺，结果表明：拟目乌贼肌肉多糖碱提法的最佳工艺条件为：提取温度90℃、NaOH浓度3%、料液比1∶28g/mL，在此条件下，拟目乌贼肌肉多糖得率为 0.68%，高于南极磷虾［23］、海螵蛸［24］多糖提取的得率，与拟目乌贼［11］、鲍鱼［25］的得率相当。

碱提拟目乌贼肌肉多糖在浓度为10 mg/mL条件下，对DPPH自由基的清除率为68%，其IC50值为7.62 mg/mL；对·OH自由基的清除率为45.72%，其IC50值为12.44 mg/mL；还原力大小为0.263。聂少平等［26］采用90℃搅拌提取茶叶多糖对DPPH自由基的清除率为35.7%；戴宏杰等［11］研究拟目乌贼生殖腺多糖在浓度为10 mg/mL条件下，对·OH自由基清除率为39.77%；罗晓航等［1］研究表明，酶法提取鲍鱼脏器粗多糖对·OH自由基的IC50值为20 mg/mL，本试验结果与上述报道的结果相比较好。殷红玲等［27］采用酶液提取的虾夷扇贝内脏多糖，在浓度为6.5 mg/mL条件下，对·OH自由基清除率达到84.75%，其IC50值为1.3 mg/mL；陈炼红等［28］采用复合酶法提取松茸多糖，该糖对DPPH自由基具有较强的清除作用，其IC50值为0.454 mg/mL；朱晓宦等［29］发现水提马齿苋粗多糖对羟基自由基的半清除浓度为3.5 mg/mL；王雪等［30］研究发现，蛹虫草基质多糖在浓度为2 mg/mL时，对DPPH自由基的清除率高达90%；本研究还发现超声波－酶提法所得多糖的总还原力最高，当多糖浓度为2.0 mg /mL时，其总还原力高达 0.306，上述文献［27～30］报道的抗氧化活性结果优于本实验结果。程知庆等［4］研究干燥方法对瘤背石磺多糖还原力的影响，结果表明当浓度为10 mg/mL时，冻干多糖的还原能力约0.25，与本实验结果接近。

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（责任编辑 白雪娜）

Optimization of alkaline extraction technology of polysaccharides from muscle of Sepia lycidas and study on its antioxidant activity

SUN Yu-lin1，2，CHEN Xi-kun1，HUANG Guan-peng1，CHEN Jing-jing1，CHEN Wei1，ZHANG Chuan-yao1，ZHOU Ying1，CHEN Dao-hai1，2
（1.Life Science and Technology School，Lingnan Normal University，Zhanjiang 524048，China；2.Round Beibu Gulf Institute for the Protection and Utilization of Marine Animals in Medicine，Zhanjiang 524048，China）

TS201.2

A

1004-874X（2017）06-0120-09

孙玉林，陈锡堃，黄冠鹏，等.碱提拟目乌贼肌肉多糖工艺优化及抗氧化活性研究［J］.广东农业科学，2017，44（6）：120-128.

2017-04-20

广东省自然科学基金（2015A030310406）；广东省教育厅特色创新项目（2016KTSCX081）；广东省省部产学研合作专项（2013B090500036）；湛江市财政资金科技专项竞争性分配项目（2013A05004, 2015A06008）

孙玉林（1980-），男，博士，讲师，E-mail：sunyulin07002@126.com

陈道海（1963-），男，教授，E-mail：dhchen11@21cn.com.