王纪坤，王立丰，安 锋，谢贵水

（中国热带农业科学院橡胶研究所/农业部儋州热带作物科学观测试验站，海南 儋州 571737）

巴西橡胶树逆境响应基因HbPRX53的克隆与表达分析

王纪坤，王立丰，安 锋，谢贵水

（中国热带农业科学院橡胶研究所/农业部儋州热带作物科学观测试验站，海南 儋州 571737）

在干旱胁迫下，橡胶树过氧化物酶活性显著增加。为了研究干旱响应的过氧化物酶基因功能，从橡胶树中克隆了HbPRX53全长DNA。生物信息学分析结果表明，HbPRX53含有334个氨基酸和1个植物过氧化物酶结构域。聚类分析结果发现，其与拟南芥过氧化物酶AtPRX53最相近。HbPRX53在橡胶树树皮、叶片、胶乳和花中均有表达，但在叶片中表达量最高，白粉菌侵染、机械伤害和干旱显著上调叶片中HbPRX53的表达。此外，吲哚乙酸、脱落酸、水杨酸乙烯、过氧化氢和茉莉酸处理也会上调HbPRX53表达。这说明HbPRX53与橡胶树对生物和非生物胁迫的响应密切相关。

干旱；HbPRX53；橡胶树；激素

Abstract：Peroxidase activity significantly increased under drought stress in rubber tree. To identify the functions of peroxidase genes responsive to drought stress，the full-length cDNA of HbPRX53 was isolated from rubber tree. Bioinformatics analysis showed that HbPRX53 contained 334 amino acid residues and a plant peroxidase-like superfamily domain. Phylogenetic analysis with Arabidopsis Class III peroxidases revealed that HbPRX53 shared high identities with AtPRX53. Although HbPRX53 was expressed in bark，leaf，latex and flower，it was preferentially expressed in leaf in rubber tree. HbPRX53 expression was significantly upregulated in leaves by powdery mildew infection，mechanical wounding and drought stress. Moreover，indole acetic acid，abscisic acid，salicylic acid ethylene，H2O2and methyl jasmonate treatments also led to marked accumulation of HbPRX53 transcripts in leaves. These results indicated HbPRX53 is a key factor in both biotic and abiotic stress responses in rubber tree.

Key words：drought；HbPRX53；rubber tree；hormone

过氧化物酶（EC1.11.1.7）是一类以血红素为辅基的酶，在生物中广泛存在，具有多种不同的生物功能，主要催化过氧化氢对多种有机物和无机物的氧化作用［1-2］。过氧化物酶家族可分为3个亚家族：第1族为胞内过氧化物酶，包括细菌过氧化物酶、抗坏血酸、过氧化氢和细胞色素C氧化酶等；第2族为真菌分泌的过氧化物酶，如木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶；第3族为植物过氧化物酶，通过信号肽定位在分泌路径［3］。植物过氧化物酶在众多组织中表达，并在植物代谢和生理过程中起作用，如氧化胁迫响应、种子外衣黏液分泌、木质化、栓化作用、生长素代谢、乙烯合成、细胞壁交联、防御真菌侵染和盐胁迫等［4-5］。迄今为止，拟南芥中发现73个过氧化物酶家族成员［6］，并鉴定了部分基因功能［3］。AtPER53，也叫PRXR1（At4G21960.1），参与病虫害胁迫［7］、干旱响应［8］、ABA 调控种子萌发等生理过程［9］。

中国是橡胶树（Hevea brasiliensis Muell.Arg.）非传统植胶区。中国橡胶树种植经常受寒害、干旱和风害的威胁［10-11］。植物对逆境的响应与激素信号等信号间交互有关，如脱落酸（ABA）、茉莉酸（JA）和乙烯（ET）等。尽管报道了多种逆境条件诱导过氧化物酶活性，但对橡胶树中的过氧化物酶的功能尚不清楚，例如，用生化方法仅在橡胶树树皮和细胞悬浮液中分离出1个过氧化物酶［12］；橡胶树中过表达活性氧相关基因HbCuZnSOD导致橡胶树抗干旱能力增强和过氧化物酶活性增高［13］；我们最近还发现干旱会导致过氧化氢含量和过氧化物酶活性上升［14］。据此，我们推测过氧化物酶在橡胶树逆境抗性中具有重要作用。本研究从橡胶树叶片中克隆过氧化物酶HbPRX53基因，并分析其在不同逆境和激素处理条件下的表达规律，为研究过氧化物酶在橡胶树逆境响应中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以位于中国热带农业科学院实验场二队15年生巴西橡胶树品种热研7-33-97成龄开割树为材料，进行组织表达分析。以中国热带农业科学院实验场五队培育的热研7-33-97一年生芽接苗为材料，选取均匀一致的4蓬叶且顶篷叶片处于稳定期的芽接苗进行白粉菌侵染、机械伤害、干旱和激素处理［14-15］。

1.2 试验方法

1.2.1 材料处理方法 采集巴西橡胶树品种热研7-33-97成龄开割树顶棚稳定期叶片、4月盛开的花、正常3 d一刀割取的胶乳和树皮，用于组织表达分析。以热研7-33-97一年生芽接苗为材料，白粉菌侵染采用在变色期叶片人工接种橡胶树白粉菌的方法，根据叶片感病程度分级，收集0、1、3、5、7级叶片。机械伤害采用宽头镊子夹伤橡胶树叶片表皮的方法，收集0.5、1、2、6、10、24 h的叶片，以未处理的植株作为对照。干旱处理采用浇饱和水后断水的方法，连续采集0～10 d的叶片。激素和过氧化氢处理分别采用100 μmol/L吲哚乙酸（IAA）、200 μmol/L脱落酸（ABA）、5 mmol/L水杨酸（SA）、1.0% （V/V）乙烯利（释放乙烯，ET）、2%（V/V）过氧化氢（H2O2）和200 mmol/L茉莉酸甲酯（MeJA）喷施橡胶树叶片，分别在0、0.5、2、6、10、24、48、72 h采集叶片样品，所有药剂用0.05% （V/V）乙醇进行溶解，对照植株喷施0.05% （V/V）乙醇水溶液。

1.2.2 总RNA提取 从上述处理收集的树皮、叶片、胶乳和花中提取总RNA［15］，使用RNasefree DNase （Promega）去除基因组DNA，提取的RNA质量和浓度使用琼脂糖凝胶电泳和超微量核酸蛋白分析仪（Thermo Fisher Nanodrop 2000，USA）进行检测。

1.2.3 HbPRX53全长cDNA的克隆 根据GenBank上公布人类、拟南芥和蓖麻等过氧化物酶蛋白序列，在橡胶树EST数据库中做tBlastn搜索，通过DNAman软件拼接同源片段，得到巴西橡胶树HbPRX53基因的cDNA序列［16］。采用Primer 6.0软件设计基因特异引物HbPRX53-F1（5′-ATGGGTGCCAAAGCTCTTTTCTTC-3′）和HbPRX53-R1 （5′-CTAGAAAAGTAACGAT GTTTCTG-3′），以反转录的cDNA第1链为模板，扩增巴西橡胶树过氧化物酶基因的cDNA序列。使用2×Taq PCR MasterMix（天根生化，北京）进行PCR扩增，反应体系为：cDNA 2 μL，上游引物（10 μ/mol L）1 μL，下游引物（10 μmol/ L）1 μL，2×PCR MasterMix 25 μL，加ddH2O至50 μL。PCR扩增程序为94℃变性 3 min，94℃变性30 s，55℃退火 50 s，72℃延伸2 min，共35个循环，最后72℃延伸10 min。扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳后，切下目的片段，凝胶回收纯化，并克隆到pMD19-T载体上，经菌落PCR检测，测序验证。

1.2.4 蛋白结构和生物信息学分析 采用NCBI ORF Finder在线分析预测过氧化物酶基因编码的氨基酸序列及其ORF，通过Expasy的ProtParam在线分析巴西橡胶树过氧化物酶蛋白中各种氨基酸含量，并预测理论分子量和等电点［19］；用 NCBI Conserved Domains数据库和SMART在线分析软件分析蛋白结构［20］；用SignalP 4.1 Server在线分析信号肽结构；用TMHMM 2.0 Server在线分析蛋白跨膜结构域［21］。在NCBI蛋白数据库中通过blastp搜索其他物种的过氧化物酶同源蛋白并获取其序列，利用MEGA7.01软件进行多重序列比对和构建系统进化树，其中bootstrap设为1 000［22］。

1.2.5 cDNA合成和荧光定量PCR 利用RNA反转录试剂盒（RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit，Fermentas）进行cDNA合成。荧光定量引物为（HbPRX53-F2：5′-GAGAAGG AGACAGACAGAAG-3′ HbPRX53-R2：5′-T AGCAGACAGCACAAGGA-3′; PCR产物预期大小124 bp ），内参基因为HbActin （GenBank登录号：HO004792），引物同文献［21］。采用2-ΔΔCT法分析表达量，即用处理的表达量减去对照的表达量，以表达量差值作为不同处理下的表达结果［22-23］。

1.3 统计分析

采用SPSS软件（版本号23）进行统计分析，采用单因素方差分析和Duncan’s检验分析不同处理间基因表达的差异显著性。采用Origin2017科技绘图软件作图。

2 结果与分析

2.1 巴西橡胶树HbPRX53基因克隆与生物信息学分析

利用引物HbPRX53-F1、HbPRX53-R1和RT-PCR技术从橡胶树基因组序列中克隆得到HbPRX53基因。HbPRX5基因（GenBank 登录号：KM086712）全长1 179 bp，包括29 bp 5′-UTR（非编码区）、148 bp 3′-UTR和1 002 bp ORF（开放读码框），编码334个氨基酸（图1）。HbPRX53蛋白的分子量为34.8 ku，等电点为5.08，是疏水性蛋白。生物信息学表明，HbPRX53是典型的过氧化物酶蛋白，在30～331位氨基酸处具有保守性过氧化物酶结构域（图2，封二）。该蛋白不具有跨膜结构域，在29～30位氨基酸间存在1个信号肽。同源序列比对分析发现，HbPRX53蛋白与天蓝遏蓝菜NcPRX（JAU25708.1）、可可树TcPRX2（EOY09519.1）、拟南芥AtPRX53（OAO93826.1）、大豆 GsPRX53（KHN41710.1）的相似性分别达到84%、83%、79%和77%。与所有拟南芥的过氧化物酶进行比对，发现HbPRX53与AtPRX53最为相近（图3）。

图 1 HbPRX53 cDNA区域的核苷酸和推导氨基酸序列

图 4 HbPRX53 在不同组织（树皮、叶片、胶乳、花）和不同胁迫（白粉菌侵染、机械伤害和干旱处理）下的表达比较

2.2 HbPRX53的表达分析

2.2.1 HbPRX53在树皮、叶、胶乳和花中的表达分析 组织分析表明，HbPRX53基因在树皮、叶、胶乳和花中均有表达，其中叶片中基因的表达量最高，是胶乳中的1 150倍，树皮和花中的表达量是胶乳中的100倍和37倍（图4）。

2.2.2 白粉菌侵染、机械伤害和干旱处理叶片中HbPRX53的表达分析 从图4可见，在白粉菌侵染后不同级别叶片中，HbPRX53基因的表达量在诱导初期显著上升，随后又恢复到处理前水平，但在5级病害时表达量又明显上升。在机械伤害后6 h，HbPRX53基因的表达量先显著上升再显著下降，在10 h达到表达最高值，是处理后0.5 h的6倍。断水处理后1 d，基因表达量明显上升，第2天表达量又恢复处理前水平，在第3天基因表达量达到最高值，是处理前的7倍，随后又显著下降，但仍高于处理前水平。说明HbPRX53与橡胶树对生物和非生物的胁迫响应有关。

2.2.3 IAA、ABA、SA、ET、JA 和H2O2处理叶片中HbPRX53的表达分析 HbPRX53基因在各种激素和H2O2的诱导下表达模式如图5所示。在IAA和H2O2处理后2 h内基因表达量显著下降，在6 h内都显著上升。随后H2O2诱导基因表达量显著下降，IAA在处理后48 h，再次诱导基因上调表达，达到表达量最高值，是处理前的4.5倍。在ABA、SA、ET和JA诱导下，HbPRX53基因在处理后2 h内，表达量先显著上升后显著下降。在处理后6 h，基因表达量又显著上升，其中ET和JA表达量达到最高值，分别是处理前的9倍和4.5倍，ABA在处理后10 h达到表达量最高值，SA则在处理后48 h达到最高值，是处理前的8.2倍。HbPRX53基因在5个植物激素和H2O2的分别诱导下，均是在2 h达到表达量的最低值。

图 5 HbPRX53在5种激素和H2O2处理下的表达比较

3 讨论

植物的过氧化物酶大多含有一个特征性结构域——分泌过氧化物酶结构域。本文中HbPRX53蛋白的30～331位氨基酸为此特征结构域。植物中广泛存在的第3类过氧化物酶均带有信号肽，主要通过分泌途径起作用［26］。生物信息学分析表明，HbPRX53是疏水性蛋白，含有信号肽，蛋白序列与其他过氧化物酶成员高度保守，在系统进化上与拟南芥AtPRX53最为接近，综上分析说明，HbPRX53是过氧化物酶家族第3族成员。

橡胶树的另一个过氧化物酶HbPRX42在花和胶乳中显著高表达，是参与生殖过程和胶乳新陈代谢相关的过氧化物酶［27］。辣椒CavPrx 在花中高表达，参与花粉管延伸［28］。水稻的21个过氧化物酶基因，主要都在根中表达［29］。拟南芥大部分过氧化物酶基因在所有组织器官中均有高量表达［30］。HbPRX53与拟南芥过氧化物酶基因在组织表达上具有相似性，主要在叶片中起作用。本研究发现HbPRX53在叶片中显著表达，在树皮、胶乳和花中均有表达，但表达量显著低于叶片中的表达量。说明不同过氧化物酶成员在植物不同组织中的表达具有差异性。

植物基因组众多的过氧化物酶基因参与众多生理过程和激素信号［31］，其蛋白结构与功能之间显著相关［6］。这在拟南芥、水稻和大麦中均有深入研究［32］。前人研究表明，过氧化物酶基因专化性很强，并多与活性氧清除有关［4］，参与抗逆胁迫和植物激素信号转导［33］。本研究发现HbPRX53受干旱和机械伤害后，先显著上调表达，后显著下调表达，这与前人研究结果一致［8，14-15］。PRXs能够通过催化细胞壁的交联部位，创造一个物理屏障来限制寄主组织中真菌，响应不同的刺激，如机械伤害和真菌侵染。本研究中，在白粉菌侵染作用下，橡胶树叶片中HbPRX53的表达量先显著上升，后显著下降，与机械伤害作用下基因的表达模式相同。说明HbPRX53在生物和非生物胁迫下，基因的表达量均受到诱导，具有PRXs家族普遍存在的功能［34］。

研究表明，植物激素能够诱导抗病相关基因表达量增加，包括SA、JA和ET［33］。SA具有一定的抗真菌病害能力［36］，JA和ET的信号途径会影响植物生长和防御响应［37］。本研究中，在SA、ET和JA 3种激素分别作用下，HbPRX53的基因表达模式相同，且符合前人的研究结果，均是在处理初期显著上升，在处理2 h表达量达到最低值，随后又显著上升。ET和JA都是在处理后6 h调控HbPRX53表达到最高值。由于H2O2是生物和非生物胁迫应答下普遍会产生的一种化学成分［38］，推导其在信号传导途径中起到相互调节的作用，是交叉耐受性的一个信号分子［39］。ABA在植物面临胁迫和诸多生理过程中也有着重要作用［40］。本研究中，HbPRX53 在H2O2刺激下，基因表达量先显著下降再显著上升后又显著下降。与干旱和机械伤害作用下基因的表达模式正好相反，推测该基因在受到胁迫时初期显著表达，随后由于H2O2的大量产生，基因表达量变化模式受H2O2的影响。可见，HbPRX53在橡胶树抗逆响应中具有重要作用，有必要深入研究其结构功能和调控机制。

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（责任编辑 崔建勋）

Cloning and gene expressions of stress responsive gene HbPRX53 in rubber tree

WANG Ji-kun，WANG Li-feng，AN Feng，XIE Gui-shui
（Rubber Research Institute，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Danzhou Investigation &Experiment Station of Tropical Crops，Ministry of Agriculture，Danzhou 571737，China）

S794.1；Q786

A

1004-874X（2017）06-0063-08

王纪坤，王立丰，安锋，等.巴西橡胶树逆境响应基因HbPRX53的克隆与表达分析［J］.广东农业科学，2017，44（6）：63-70.

2017-04-26

海南省自然科学基金（20153151）；国家现代农业产业技术体系建设专项（CARS-34-ZP1）；中国热带农业科学院橡胶研究所基本科研业务费专项（1630022015013）

王纪坤（1979-），男，硕士，助理研究员，E-mail：kunjiwang@163.com

谢贵水（1967-），男，博士，研究员，E-mail：xie23300459@163.com