金福源 朱国良 （江苏省苏州市吴江区动物卫生监督所盛泽分所 215200）

夏晓潮 （广东省茂名市林业有害生物防治检疫管理办公室 525000）

姚小兵 陈永中 李明观 徐国东 （江苏省苏州市吴江区动物卫生监督所黎里分所 215200）

几种猪蓝耳病检测诊断方法比较分析

金福源 朱国良 （江苏省苏州市吴江区动物卫生监督所盛泽分所 215200）

夏晓潮 （广东省茂名市林业有害生物防治检疫管理办公室 525000）

姚小兵 陈永中 李明观 徐国东 （江苏省苏州市吴江区动物卫生监督所黎里分所 215200）

猪繁殖与呼吸综合征俗称蓝耳病，主要引起猪的繁殖障碍以及各种呼吸系统症状，临床上给养殖户造成了巨大的经济损失，为了更好的控制猪蓝耳病的流行，本文从其诊断检测方法入手，分析了目前检测该病主要方法的优劣势以及存在的问题，并对这些方法的使用条件进行说明，为诊断与控制该病的发生提供依据。

蓝耳病；检测；诊断方法；分析

猪蓝耳病是近几年比较流行的病毒性传染病，给养猪业造成重大损失，如果能尽早发现本病，将大大提高猪群成活率，减少损失。这就要求提高诊断水平，但本病诊断方法中很多受检测设备、人员操作和环境条件的影响，不能很好的应用于临床实践。为了提高对本病检测技术的认识，本文针对当下主要猪蓝耳病病原检测技术进行分析，以便能更好的服务于实际生产。

1 猪蓝耳病简介

猪蓝耳病又叫猪繁殖与呼吸综合征，是一种能够引起猪生殖系统和呼吸系统出现机能障碍的病毒性传染病，首次病例于1987年被发现于美国，近几年来由于病毒的不断变异，对控制和扑灭本病提出更严峻的挑战。母猪发病后主要表现流产、死胎以及木乃伊胎等严重的繁殖障碍，断奶仔猪普遍发生肺炎、生长迟缓等。我国已将其列为二类传染病，本病传播迅速，不仅可以通过呼吸道感染，也可以垂直传播。虽然根据发病症状和剖检特征可初步作出诊断，但确诊仍需做实验室检查。

2 本病的诊断技术

2.1 临床诊断

本病因感染程度和病程不同，感染猪的表现差异性很大，根据患猪临床表现和病理变化可作出临床初步诊断。繁殖母猪感染后表现精神沉郁、厌食、发热，妊娠后期发生流产、死胎、木乃伊胎以及弱仔，患猪耳背面、边缘以及尾部皮肤发紫，皮下出现一过性血斑。组织病理检查可见有间质性肺炎特征，另外对于临床症状不明显，缺少临床症状的猪群，可参照荷兰制订的3项诊断指标，即死产至少20%以上，流产母猪至少为80%以上，断乳仔猪的死亡率至少为26%以上；符合其中的两项指标或两项以上指标，即可做出初步诊断。

2.2 实验室诊断

2.2.1 病毒分离与鉴定

病毒分离鉴定主要将感染猪的肺、死胎的肠、腹水、血清、母猪血液、鼻试子和粪便等发病部位进行病毒分离。将病料过滤处理后接种至猪肺泡巨噬细胞培养，并进行中和试验鉴定病毒。传统中和试验比较简单，但特异性和敏感性低，操作时间较长 (1周左右），不能检出早期感染的抗体，有学者曾对此方法进行改进，即在血清和病毒的混合液中加入补体，最早可在接种后8d检测出抗体，提高了此方法的敏感性。病毒中和试验需要培养单层细胞或者饲养实验动物，比较麻烦，较少应用于临床诊断。

2.2.2 血清学诊断方法

血清学检查方法是近些年应用比较多的诊断方法，尤其是蓝耳病的亚临床型和慢性型的出现后，本方法显得更为重要，目前比较常用的主要有以下几种。

(1）免疫过氧化物酶单层试验 (IPMA）

IPMA法是最早报道用于检测本病抗体的方法，由荷兰中央兽医研究所于1991年建立，是目前欧盟最常用的蓝耳病诊断方法。为了调查蓝耳病的流行情况，针对吴江地区的3个规模化猪场的105份血清进行IPMA法检测，结果如表1所示。

表1 IPMA检测猪蓝耳病血清抗体阳性率统计

从表1中可以看出，本病欧洲型抗体阳性检出率为11.43%(12/105），美洲型的抗体阳性检测率为47.62%(50/105），说明IPMA法具有很好敏感性和特异性，但欧洲性的检出率低于美洲型检出率，可能是由于在病毒增殖过程中，CPE(观察致细胞癌变作用）时间较长不易脱落，造成假阴性结果。该方法能在猪感染后6d～12个月的血清中检测到抗体，其缺点是试验结果主要靠主观判断，不能自动显示，且操作步骤复杂，费用高，有时会出现假阴性，因而不适用于大规模检测，在我国尚未广泛使用。

(2）间接免疫荧光试验 (IFA）

间接免疫荧光试验 (IFA）首先在美国应用于蓝耳病的诊断，与IPMA法相当，可在感染后2～3周检测出抗体，已经成为欧美各国官方认可的权威检测方法。本试验以美洲株为抗原，采用96孔细胞培养板为载体，建立了间接免疫荧光抗体试验 (IFA）法用于检测本病在猪群中的抗体水平。共采取168份血清，同时结合ELISA方法进行对比，结果如表2所示。

表2 IFA法与ELISA法血清抗体检测结果的比较

与ELISA法相比，168份血清中，IFA检测的阳性率为41.67%(70/168），ELISA法的检出率为 42.86%(72/168），两者的符合率为91.67%((64+90）/168）。试验证明，IFA具有良好的特异性和敏感性。但IFA法操作需要专业技术人员，且诊断结果滞后，费时费力，不能满足疫病快速诊断的需求。

(3） ELISA法

表3 不同方法对猪蓝耳病免疫抗体检阳性检出率 （阳性数/检出数）

表4 本病荧光定量RT-PCR检测检测同一头猪不同组织的结果统计

酶链免疫吸附试验 (ELISA）主要用于检测猪蓝耳病病毒抗体，可测定出感染2周的病毒抗体。目前市场上已售有各种类型的ELISA试剂盒。本研究从规模化猪场共采集血清样品50份，分别用ELISA、IPMA、VN和IFA4种方法检测本病抗体，进行对比。检测结果如表3所示。检测结果显示，通过ELISA法，在首免后第7天即可检测出部分阳性抗体，而其他3种方法则是在第10天以后才检测出阳性抗体，病毒中和试验 (VN）敏感性相对其他3种方法较低，阳性检测率仅为38%，且费时费力。通过本次试验，4种方法中，ELISA方法具有敏感性、特异性高，抗原用量少，不需要特殊仪器，快速、经济，结果便于长期保存等优点，适于短期内大批量血清样品的检测，更适合大面积推广，已有很多国家将本方法列为常规检测方法。

2.2.3 分子生物学诊断方法

分子生物学诊断方法主要为PCR反应，目前已被广泛应用于蓝耳病临床样品的检测。主要PCR检测方法有：RTPCR、实时荧光定量RT-PCR和TaqMan荧光定量RT-PCR等。根据PCR原理，参考基因库中的猪蓝耳病病毒的Nsp2基因保守区设计了一对引物，扩增目的片段为690bp，建立了一种通用RT-PCR方法，应用此方法对2011～2013年搜集的125份样品进行检测，同时结合ELISA法进行比较，结果表明，RT-PCR法检出率为44.9%，ELISA法检出率为42.54%，两者的符合率达94.66%。此结果表明，该方法具有特异、敏感、重复性好等优点，可以应用于临床发病检测以及流行病学检测。

在普通RT-PCR方法的基础上进行改进，建立荧光定量RT-PCR，通过此方法检测发病猪场的5头病死猪的不同组织脏器，并对结果进行统计，如表4所示，同一头猪的不同组织脏器的含毒量不同，各个组织含毒量由高到低大致为肺、淋巴结和肝，脾和肾，肌肉。肌肉检测量虽高，但其中两份样本却未检出，原因可能在于有些病料中含毒量很低。上述结果进一步说明，荧光定量RT-PCR敏感性高于其他方法，能够检测到猪其他组织中的微量本病的RNA病毒，这对于猪肉的食品安全监管具有重要意义。

除了灵敏度高、特异性强、检测病料组织多样化等优点之外，与血清学诊断方法相比，PCR法还能够区分高致病性蓝耳病病毒与未发生变异的传统蓝耳病毒株以及野毒株，为净化本病提供可参考的依据。

3 小结与讨论

猪蓝耳病是一个全球性问题，对世界养猪业造成重要影响，选择合适的诊断技术至关重要。猪群中暴发本病时，我们所面临的问题就是准确而又快速的给出诊断，根据诊断结果做出相应防治措施。具体到蓝耳病而言，现有的多种猪蓝耳病的诊断方法，有的方法灵敏度低、有的方法检测时间久，有的方法成本高，有的方法需要特殊的实验环境或者昂贵的实验仪器设备，有的方法需要专业技术人员，各有优劣势。对于我们广大养殖户和兽医工作者来讲，应根据自己实际情况，考虑不同方法所适用的情形，选择适合自己的诊断方法来判定本场的蓝耳病感染程度，将经济损失降低到最低。