陶 石 郝新宝 苏群豪 徐 璐 胡 敏 吴肖志军 陈 瑜 王 娇

(海南医学院第一附属医院血液内科，海南 海口 570100)

·基础研究·

miR-29b通过PI3K/AKT信号通路抑制白血病细胞的增殖

陶 石 郝新宝 苏群豪 徐 璐 胡 敏 吴肖志军 陈 瑜 王 娇

(海南医学院第一附属医院血液内科，海南 海口 570100)

目的探讨miR-29b对K562白血病细胞增殖与凋亡的影响及相关机制。方法利用LipofectamineTM2000脂质体将miR-29b mimics，miR-29b NC转入白血病细胞K562中，实时荧光定量PCR法检测miR-29b表达，MTT法检测细胞活力，EdU染色法检测细胞增殖情况，流式细胞术检测细胞周期，Western印迹检测细胞中B淋巴细胞瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)，髓样细胞白血病(MCL)-1，细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)4，CDK6蛋白表达及磷脂酰肌醇3 激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)激活情况。结果与miR-29b NC组比较，miR-29b mimics组miR-29b表达上调(P<0.01)，细胞活力及细胞增殖率降低(P<0.01)，细胞周期阻滞在G1期(P<0.01)，Bcl-2，MCL-1，CDK4，CDK6，PI3K及p-AKT表达量均明显下调(P<0.01)，Bax表达量明显上调(P<0.01)。结论miR-29b mimics能显著抑制白血病细胞K562增殖、诱导细胞凋亡，可能与阻断PI3K/AKT信号通路有关。

miR-29b；白血病；K562；增殖；凋亡

白血病的发生和发展是一种多因素，多机制参与调控的复杂过程，涉及基因的突变、表观遗传学的改变等〔1，2〕。miRNA是一种真核生物中高度保守的小分子RNA，与肿瘤的发生发展密切相关，引起学者的广泛兴趣〔3～5〕。研究已经表明众多的miRNA在急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓系细胞白血病(AML)、慢性粒细胞白血病(CML)及慢性淋巴细胞白血病(CLL)等多种白血病中差异表达，并与白血病的发生发展密切相关〔3～5〕。miR-29家族是近年来热门研究的miRNA之一，研究显示miR-29家族成员在AML、CML等血液肿瘤中低表达〔4,6,7〕，但具体的作用机制还尚未见报道。本研究拟探讨miR-29b对CML K562细胞增殖与凋亡的影响及相关机制。

1 材料和方法

1.1试剂与仪器 兔抗人Bcl-2相关X蛋白(Bax)、B淋巴细胞瘤(Bcl)-2、髓样白血病(MCL)-1，细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)4、CDK6、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、GAPDH单克隆抗体均购自美国Cell Signal Technology公司；兔抗人蛋白激酶B(AKT)，磷酸化(p)-AKT多克隆抗体均购自美国Abcam公司；四甲基偶氮唑盐(MTT)、DMEM培养基均购自美国Gibco公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒均购自购自南通碧云天生物技术有限公司；细胞周期检测试剂盒均南京凯基生物技术有限公司；TRIzol总RNA提取试剂盒、一步法RT-PCR试剂盒、LipofectamineTM2000均购自美国Invitrogen公司；miR-29b mimics、miR-29b NC、EdU细胞增殖检测试剂盒均购自广州市锐博生物科技技术有限公司。DYCZ-25D型双垂直电泳仪，DYCZ-25D型转印电泳仪均购自北京六一生物科技有限公司；ChemiDocTM XRS凝胶成像系统购自美国伯乐公司；FACSCalibur流式细胞仪购自美国BD公司；MK3酶标仪购自美国Thermo公司；TS100倒置荧光显微镜购自日本Nikon公司。

1.2细胞株 CML K562细胞购于中国科学院细胞库，用含有10%胎牛血清的DMEM培养基培养，每隔2 d以1∶3的比例进行传代，选取对数生长期的细胞用于后续的实验研究。

1.3实时荧光定量PCR检测K562细胞中miR-29b的表达 当K562细胞生长密度达到50%的时候，利用LipofectamineTM2000脂质体将miR-29b mimics及miR-29b NC转染到K562细胞中，6 h后换液，继续培养48 h，利用胰蛋白酶消化细胞，根据TRIzol总RNA提取试剂盒提取细胞总RNA并检测总RNA纯度，通过一步法RT-PCR试剂盒将RNA逆转录成cDNA，最后将cDNA进行实时荧光定量PCR，扩增结果利用2-ΔΔCT法进行分析。miR-29b上游引物：5'-TGGTTTCATATGGTGGTTTA-3'，下游引物：5'-ATAACCGATTTCAGATGGTG-3'，GAPDH上游引物：5'-AGCCACATCGCTCAGACA-3'，下游引物：5'-TGGACTCC-ACGACGTACT-3'。

1.4MTT法检测K562细胞活力 将5×103个K562细胞接种到96孔板，培养24 h后，利用LipofectamineTM2000脂质体将miR-29b mimics及miR-29b NC转染到K562细胞中，继续培养48 h后，加入20 μl的MTT(终浓度为5 mg/ml)孵育4 h后，吸弃上清液，再加入150 μl的二甲基亚砜，震荡使结晶物溶解，用酶标仪于波长560 nm处测OD值，每组3个复孔。

1.5EdU染色检测K562细胞增殖情况 将5×103个K562细胞接种到96孔板，培养24 h后，利用LipofectamineTM2000脂质体将miR-29b mimics及miR-29b NC转染到K562细胞中，继续培养48 h，每孔加入50 μmol/L的EdU染液并孵育2 h，PBS洗涤3次；接着加入4%多聚甲醛固定30 min，后加入50 μl浓度为2 mg/ml的甘氨酸摇床孵育5 min，同时加入100 μl 0.5%的TritonX-100进行渗透加强，PBS洗涤3次。每孔加100 μl1×Apollo染色液室温避光反应30 min，PBS洗涤3次。每孔继续加入100 μl Hoechst33342染色液，于室温避光反应30 min，PBS洗涤3次。最后于荧光显微镜下观察并拍照，每组3个复孔。

1.6流式细胞术检测K562细胞周期 将1×104个K562细胞接种到6孔板，培养24 h后利用LipofectamineTM2000脂质体将miR-29b mimics及miR-29b NC转染到K562细胞中，继续培养48 h后，每组首先收集1×105/ml个细胞，再加入5 μl的Rnase(终浓度为10 mg/ml)，吹打混匀后，37℃孵育1 h，再加入PI染液，吹打混匀并于室温避光孵育30 min，1 h内在流式细胞仪进行细胞周期检测分析，每组3个复孔。

1.7Western印迹检测K562细胞中蛋白的表达 将1×104个K562细胞接种到6孔板，培养24 h后，利用LipofectamineTM2000脂质体将miR-29b mimics及miR-29b NC转染到K562细胞中，继续培养48 h，在冰浴条件下刮下6孔板中细胞，离心收集细胞并加入细胞裂解液，裂解30 min，离心获得的上清液即为总蛋白，利用BCA试剂盒测定蛋白浓度。蛋白煮沸10 min进行变性、上样，进行十二烷基苯磺酸钠凝胶电泳1～2 h，湿法转膜30～50 min。5%脱脂奶粉封闭1 h，一抗溶液(兔抗人Bax、Bcl-2、MCL-1、CDK4、CDK、PI3K、GAPDH单克隆抗体稀释度为1∶100；兔抗人AKT、p-AKT多克隆抗体稀释度为1∶200)孵育，4℃过夜；二抗溶液室温孵育1～2 h。在凝胶成像系统中曝光，每组3个复孔。

1.8统计学分析 应用SPSS17.0软件行t检验。

2 结 果

2.1miR-29b mimics转染的验证 miR-29b NC及miR-29b mimics转染K562细胞48 h后，miR-29b mimics组中miR-29b表达量(1.48±0.14)显著高于miR-29b NC组的(0.34±0.03)(P<0.01)，说明miR-29b mimics转染成功。

2.2miR-29b mimics对K562细胞活力、增殖及细胞周期的影响 miR-29b NC及miR-29b mimics转染K562细胞48 h后，miR-29b mimics组细胞活力(0.35±0.03)显著低于miR-29b NC组(0.79±0.08)(P<0.01)。miR-29b mimics组细胞增殖率(10.29±1.04)%显著低于miR-29b NC组的(30.42±3.05)%(P<0.01)，见图1。miR-29b NC及miR-29b mimics转染K562细胞48 h后，miR-29b mimics组细胞周期G1期明显比miR-29b NC组延长，说明miR-29b mimics使K562细胞周期阻滞在G1期。见表1。

2.3miR-29b mimics对K562细胞中细胞周期及细胞凋亡相关蛋白表达的影响 miR-29b NC及miR-29b mimics组转染K562细胞48 h后，与miR-29b NC组比较，miR-29b mimics组Bcl-2、MCL-1、CDK4及CDK6表达量均明显下调(P<0.01)，Bax表达量明显上调(P<0.01)。见图2、表2。

图1 miR-29b mimics对K562细胞增殖的影响(×200)

组别G1SG2miR-29bNC组46.85±4.6835.61±3.0617.54±1.70miR-29bmimics组57.79±5.781)30.38±3.531)11.83±1.201)

与miR-29b NC组比较：1)P<0.01，下表同

表2 miR-296 mimics对K562细胞凋亡和细胞周期相关蛋白表达水平的影响

2.4miR-29b mimics对K562细胞中PI3K/AKT信号通路的影响 miR-29b NC及miR-29b mimics转染K562细胞48 h后，miR-29b mimics组PI3K及p-AKT表达量显著低于miR-29b NC组(P<0.01)。见图3，表2。

图2 miR-296 mimics对K562细胞凋亡和细胞周期相关蛋白表达水平的影响

图3 miR-29b mimics 对PI3K/AKT细胞信号通路的影响

3 讨 论

miRNA与肿瘤的发生发展密切相关〔8〕。首次在白血病的研究中证实miRNA在肿瘤中存在差异表达，后续研究证实miRNA可能作为癌基因或者抑癌基因参与白血病的发生发展〔3～5〕。已有众多学者利用miRNA芯片技术证实了miRNA在ALL、AML、CML及CLL中的异常表达，其中包括miR-29家族〔3～5〕。研究表明，miR-29-29b在白血病中表达下调，与白血病的发生、发展及预后密切相关〔4,6,7〕。另外研究还表明，miR-29b能够使多种潜在的靶基因(MCL-1、CDK4、CDK6、Bcl-2、p53及CCND2等)沉默，进而调控细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡等生物学行为〔9〕。但是对于miR-29b在白血病中的具体作用机制还不甚清楚。本研究结果表明miR-29b mimics能显著降低细胞活力及增殖率。肿瘤细胞的恶性克隆源自细胞周期的不可控制，因此调控细胞周期点(G1期及G2期)成为众多抗癌药物的作用靶点〔10,11〕。后续的流式细胞术结果表明miR-29b mimics能显著延长G1期，使细胞周期阻滞在G1期，导致细胞复制停滞于DNA合成的前期，从而抑制K562细胞的恶性增殖，与miR-29b mimics在宫颈癌细胞中的作用一致〔12〕。

细胞的凋亡受细胞凋亡相关基因严格调控，其中研究最为广泛的是Bcl-2蛋白家族，Bcl-2是最常见的抑凋亡蛋白，能与促凋亡蛋白Bax形成异二聚体，阻断凋亡信号的传递，促进细胞的存活及生长。Bax能自身形成二聚体，将凋亡信号传递给Caspase家族，最终诱导细胞凋亡。MCL-1也是常见的抗凋亡蛋白，能与Bcl-2家族中某些蛋白的BH3-only蛋白结合，抑制Bax/Bak二聚体的凋亡诱导作用，最终阻断细胞凋亡。细胞凋亡受限源于细胞增殖的不可控制，即细胞周期的不可控制，细胞周期蛋白D1必须与CDK4/CDK6结合形成复合物，才能使核转录因子E2F进入细胞核，推动与细胞增殖相关基因的转录，促进G1期向S期转变。有研究表明MCL-1、CDK4、CDK6、Bcl-2可能是miR-29b的潜在靶基因〔9〕。本研究结果表明，miR-29b mimics能显著下调K562细胞中Bcl-2、MCL-1、CDK4及CDK6表达，上调Bax表达，最终抑制K562细胞增殖并诱导细胞凋亡。CML主要分子学特征是BCR/ABL癌蛋白，此蛋白能够通过酪氨酸激酶活性激活下游信号通路促进细胞的恶化，PI3K/AKT就是其中一种重要的通路〔4,13〕。PI3K是由催化亚单位p110和调节亚单位p85组成的二聚体，能够将下游底物二磷酸磷脂酰肌醇(PIP)2的3'羟基磷酸化，使之成为PIP3，PIP3进而促使AKT蛋白结构发生改变并磷酸化，而活化后的AKT能够激活下游靶基因(如Bcl-2家族、MMPs等)有进而参与细胞的增殖、凋亡等生物学行为〔14〕。同时有研究还表明，miR-29b能够通过PI3K/AKT信号通路降低胃癌细胞对顺铂的耐受性〔15〕。本研究发现miR-29b mimics能显著下调PI3K及p-AKT表达，进而抑制K562细胞增殖并诱导细胞凋亡。

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〔2017-06-08修回〕

(编辑 郭 菁)

MechanismandeffectofmiR-29bonproliferationandapoptosisinleukemiacell

TAOShi，HAOXin-Bao,SUQun-Hao，etal.

DepartmentofHematology,theFirstAffiliatedHospitalofHainanMedicalUniversity,Haikou570100,Hainan,China

ObjectiveTo explore mechanism and effect of miR-29b on proliferation and apoptosis in leukemia cell K562.MethodsmiR-29b mimics and miR-29b NC were transfected into K562 cell by liposome LipofectamineTM2000. The expression of miR-29b was detected by Quantitative Real-time PCR. Cell viability was measured by MTT assay. Cell proliferation was measured by EdU staining. Cell cycle was measured by flow cytometry. The expressions of B-cell lymphoma-2 (Bcl-2), Bcl-2 associated X protein (Bax), myeloid cell leukemia(MCL)-1, cell cyclin-dependent kinase(CDK)4 and CDK6, the activation of phosphatidylinositol 3 kinase (PI3K)/protein kinase B (AKT) signal pathway were measured by Western blot.ResultsCompared with miR-29b NC, the expression of miR-29b was up-regulated (P<0.01), cell viability and cell proliferation were reduced (P<0.01), cell cycle was made arrested in the G1 phase (P<0.01), the expressions of Bcl-2, MCL-1, CDK4, CDK6, PI3K and p-AKT were down-regulated (P<0.01), the expression of Bax was up-regulated in miR-29b mimics group (P<0.01).ConclusionsmiR-29b mimics could inhibit K562 cell proliferation and induce cell apoptosis via blocking PI3K/AKT signal pathway.

miR-29b; Leukemia; K562; Proliferation; Apoptosis

R3

A

1005-9202(2017)18-4429-04；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.001

国家自然科学基金资助项目(No.81460035)

郝新宝(1966-)，男，博士，主任医师，教授，主要从事肿瘤靶向药物开发和基因治疗方面的研究。

陶 石(1982-)，女，硕士，主治医师，主要从事血液病基础和临床研究。