郭松喜 王英 刘春生 周静超 张睢扬 王丹

·论著·

利用微透析技术研究美罗培南在正常大鼠和脓毒症大鼠不同靶部位的回收率

郭松喜1，2王英2刘春生3周静超4张睢扬2王丹4

目的探讨美罗培南微透析探针在正常大鼠和脓毒症大鼠不同靶部位的回收率。方法随机将大鼠分为两组：假手术组(1只)和脓毒症组(3只)。分别将探针置入大鼠的皮肤、肌肉、血管及肺部，收集样品，测定不同部位的回收率。结果对于所研究的靶部位(肺、血管、皮肤及肌肉)，正常大鼠回收率分别为30.14%±7.62%、26.20%±0.14%、25.90%±1.28%、13.95%±0.32%，脓毒症大鼠回收率分别为46.43%±1.50%、45.96%±1.78%、33.93%±0.39%、39.48%±2.38%。美罗培南在正常大鼠所研究靶部位的回收率均低于脓毒症大鼠靶部位的回收率，对于正常大鼠及脓毒症大鼠在研究的靶部位中均是肺部回收率最高。结论美罗培南为高蛋白结合率药物，肺部蛋白含量低，而美罗培南肺部吸收最少，出现肺部回收率最高的现象。通过微透析技术研究正常大鼠和脓毒症大鼠不同靶部位的回收率，可推算出不同靶部位的药物浓度。

美罗培南； 微透析； 脓毒症大鼠； 体内回收率

脓毒症是指由感染引起的全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)，尽管近年来抗生素治疗取得了新的进展，但脓毒症病死率仍呈现不断上升的趋势[1]。究其原因是难以对脓毒症靶部位抗生素浓度进行动态观察及准确捕获，限制了对脓毒症抗生素治疗作用的深入研究。因此，本研究拟通过微透析研究美罗培南微透析探针在正常大鼠和脓毒症大鼠体内的回收率[2-5]，为研究美罗培南在脓毒症大鼠靶部位的药物浓度奠定基础[6]。

材料与方法

一、实验试剂与药品

美罗培南(中国药品生物制品检定所，生产批号：130506-200702)；复方氯化钠溶液(华润双鹤药业股份有限公司，批号：D201407171)；氯化钠注射液(石家庄四药有限公司，批号：1405041503-B)；水为三蒸水(火箭军总医院制剂室自制)，丙二醇(分析纯，北京化工厂，批号20140515)；

实验动物：4只SD大鼠(200～300 g，雄性，购自北京维通利华有限公司)

二、实验仪器

主要仪器：3200Q-Trap型MS/MS仪，美国 Applied Biosyetem公司；Agilent 1100 HPLC系统，美国Agilent公司；微透析体内外实验操作台(ZL 2014 208593710)，火箭军总医院；CMA30线性探针、CMA20血管探针、CMA470冷却微量收集器和注射器 ，瑞典CMA公司；动物保温垫，上海奥尔科特生物科技有限公司；AG285型电子天平，瑞士Mettler Toledo公司；DL-720A超声波清洗器，上海之信仪器有限公司；DF101集热式恒温加热磁力搅拌器 ，郑州巩义市予华仪器有限责任公司；XH-C涡旋混合器，江苏金坛市白塔新宝仪器厂；PARAFILM封口膜，美国Bemis公司。

手术器械：眼科剪；血管钳；弯镊；三棱针；显微镊；4号丝线；纱布；棉球；2.5 ml注射器；

三、实验步骤

1. 将4只SD雄性大鼠随机分为两组，假手术组1只，脓毒症组3只。用3%戊巴比妥钠(0.3 ml/100 g，ip)麻醉，专用眼科剪除去颈部、胸部、腹部及大腿毛发，将大鼠腹部朝上固定于保温垫上，使其体温保持在37.5 ℃左右。气管插管，接呼吸机。

2. 分别将线性探针插入皮肤及肌肉组织，血管探针插入颈内静脉及肺组织，然后将血管探针以1%的肝素钠为灌注液，以2 μl/min的速度灌注15 min。在腹正中开腹，找到盲肠，从盲肠远端1 cm处结扎盲肠，用中号圆针带7-0丝线缝穿结扎盲肠远端，并将7-0丝线双股打结，留约直径2 cm线环，以此留两个7-0线环，用2.5 ml注射器向已结扎盲肠远端注射生理盐水1 ml，然后结扎离断双侧网膜，最后关腹[7-13]；假手术组不同的是找到盲肠后，不做穿孔及结扎，从腹腔取出盲肠后直接将其放回腹腔，然后关腹。

3. 两组大鼠术后即刻皮下注射生理盐水，补充手术过程中的体液丢失，剂量5 ml/100 g体重。连接微透析装置，微透析分别以含有1%浓度的丙二醇的林格氏液溶液为灌流液，以2 μl/min灌注60 min以排除气泡及冲洗管路。然后分别用1 μg/ml、5 μg/ml、30 μg/ml含1%丙二醇的美罗培南林格氏液做灌流液，以1 μl/min的灌注速度平衡1 h，然后每30 min收集一个样本，每个浓度收集5个样本。

4. HPLC-MS/MS法测定透析液中药物浓度。通过减量法计算美罗培南的在不同大鼠体内的回收率[14]。

结 果

对于所研究的靶部位(肺、血管、皮肤及肌肉)：正常大鼠回收率分别为30.14%±7.62%、26.20%±0.14%、25.90%±1.28%、13.95%±0.32%，脓毒症大鼠回收率分别为46.43%±1.50%、45.96%±1.78%、33.93%±0.39%、39.48%±2.38%，见图1、图2。由此可见，美罗培南在正常大鼠靶部位的回收率均低于脓毒症大鼠靶部位的回收率，对于正常大鼠及脓毒症大鼠在研究的靶部位中均是肺部回收率最高。还可以看出，脓毒症大鼠体内的回收率，肺部与血管回收率基本相等，皮肤与肌肉回收率相差亦在5%左右。

图1 美罗培南在假手术组大鼠皮肤、肌肉、血管及肺部体内回收率

图2 美罗培南在脓毒症大鼠皮肤、肌肉、血管及肺部体内的回收率

讨 论

在正常情况下，内皮细胞能够感受物理或化学信号并做出反应。它通过分泌相关分子，内皮细胞调节着血管收缩，细胞粘附，出凝血功能，平滑肌细胞的增殖及血管壁的炎症反应。脓毒症中全身性炎症反应所产生的氧自由基、血管紧张素Ⅱ以及血流动力学的改变均会不同程度地引发内皮细胞损伤从而诱发微循环功能障碍[15]。微透析取样技术的原理是利用物质沿浓度梯度扩散和半透膜对小分子化合物具有通透性原理设计的。在微透析取样过程中,组织中物质(包括药物)在探针透析膜内外的分布处于一种动态平衡中,但是由于探针持续灌流(不含待测物质)的溶液,导致了药物在组织液和灌注液之间的扩散不能完全达到平衡,透析液中的药物含量只是细胞外液中的一部分[16]。出现微循环障碍后使内皮细胞通透性降低，细胞内、外液之间的平衡遭到破坏,根据减量法公式R=(Cin-Cout)/Cin[14]可以计算出脓毒症大鼠靶部位的回收率高于正常大鼠靶部位的回收率。并且，美罗培南为高蛋白结合率药物，肺部蛋白含量低，故而美罗培南肺部吸收最少，出现肺部回收率最高的现象。通过微透析技术我们可以研究正常大鼠和脓毒症大鼠不同靶部位的回收率，进而推算出不同靶部位的药物浓度。

1 牛莎, 张睢扬. 脓毒症和脓毒症休克抗感染治疗进展[J/CD]. 中华肺部疾病杂志(电子版), 2013, 6(3): 202-204.

2 Markus Müller 著. 周丁华, 王丹, 童卫杭, 等译. 微透析技术与药物研究[M]. 人民军医出版社, 2014年版, 第一章微透析技术简介, 1-3.

3 Ditz C, Bahlmann L, Klaus S, et al. Cerebral metabolism during experimental endotoxin shock and after preconditioning with monophosphoryl lipid A[J]. Clin Neurol Neurosurg, 2014, 126C: 115-122.

4 Nikitas N, Kopterides P, Ilias I, et al. Elevated adipose tissue lactate to pyruvate (L/P) ratio predictspoor outcome in critically ill patients with septic shock: a microdialysis study[J]. Minerva Anestesiol, 2013, 79(11): 1229-1237.

5 王丹, 刘春生, 吕亚丽, 等. 葛根素微透析线性探针相对回收率影响因素的研究[J]. 国际药学研究杂志, 2011, 38(5): 390-393.

6 刘春生, 刘德鼎, 王丹, 等. 高效液相色谱串联质谱法研究环磷酰胺线性微透析探针体内外校正影响因素[J]. 国际药学研究杂志, 2015, 42(3): 362-364.

7 常瑞明, 肖建强, 杨涛, 等. 盲肠不同部位结扎穿孔致脓毒症模型的研究[J]. 岭南现代临床外科, 2012, 12(1): 20-22.

8 赵金峰, 罗进, 刘世宾. 盲肠结扎穿孔致大鼠脓毒症的模型改良[J]. 浙江中西医结合杂志, 2008, 18(10): 605-606.

9 郭松喜, 王丹, 刘春生, 等. 脓毒症实验动物模型的研究进展[J/CD]. 中华肺部疾病杂志(电子版), 2015, 8(5): 635-637.

10 汤耀卿, 李磊. 脓毒症动物模型制作方略及应用[J]. 中华实验外科杂志, 2006, 23(12): 1433-1434.

11 Tang CW, Feng WM, Du HM, et al. Delayed administration of D-Ala2-D-leu5-enkephalin, a Delta-opioid receptor agonist, improves survival in a rat model of sepsis[J]. Tohoku J Exp Med, 2011, 224(1): 69-76.

12 Huber-Lang M, Barratt-Due A, Pischke SE, et al. Double blockade of CD14 and complement C5 abolishes the cytokine storm and improves morbidity and survival in polymicrobial sepsis in Mice[J]. J Immunol, 2014, 192(11): 5324-5331.

13 Wu LL, Jia BH, Sun J, et al. Protective effects of ginsenoside Rb1 on septic rats and its mechanism[J]. Biomed Environ Sci, 2014, 27(4): 300-303.

14 Markus Müller 著. 周丁华, 王丹, 童卫杭, 等译. 微透析技术与药物研究[M]. 人民军医出版社, 2014年版, 第2章微透析技术定量：回收率与校正，8-18.

15 赵光举, 卢中秋. 脓毒症内皮细胞损伤与微循环障碍[J]. 临床急诊杂志, 2012, 13(1): 8-13.

16 王丹, 石力夫, 胡晋红. 微透析技术探针回收率的影响因素研究进展[J]. 国际药学研究杂志, 2008, 35(4): 261-266.

(本文编辑：王亚南)

郭松喜，王英，刘春生，等. 利用微透析技术研究美罗培南在正常大鼠和脓毒症大鼠不同靶部位的回收率[J/CD]. 中华肺部疾病杂志(电子版)， 2017， 10(4)： 420-422.

Recovery of the meropenem micro dialysis probe in normal rats and in rats of sepsis in vivo

GuoSongxi1,2,WangYing2,LiuChunsheng3,ZhouJingchao4,ZhangSuiyang2,WangDan4.

1Departmentofrespiration,MiyunHospital,Beijing101500,China;2Departmentofrespiration;3Departmentoforthopedics;4Departmentofpharmacy,RocketArmyGeneralHospitalofPLA,Beijing100088,China

Correspondingauthor：WangDan,Email:wdyy-618@sina.con

Objective Study the recovery of the meropenem micro dialysis probe in normal rats and in rats of sepsis in vivo. Method Rats randomly divided into two groups: control group(1case)and sepsis group (3 cases). firstly, to probe into the rat skin, muscle, blood vessels and lungs, respectively, then, collect samples, and then, determination of different parts of the recovery. Result The recovery of all research target parts ( lungs, blood vessels, skin and muscles ), the normal rats were 30.14%±7.62%, 26.20%±0.14%, 25.90%±1.28%, 13.95%±0.32%. And the sepsis group were 46.43%±1.50%, 45.96%±1.78%, 33.93%±0.39%, 39.48%±2.38%. The recovery in control group were lower than target parts of the rats of sepsis group, the recovery both in control group and sepsis group at the target of the study area are highest in lung. Conclusion Meropenem was a high protein binding rate of drug, the lung protein content was low, but the pulmonary absorption of meropenem was the least, so meropenem in the lung had the highest recovery rate. By micro dialysis technology research normal and sepsis in rats of different target parts of a recovery, and then calculate different drug concentration of the target area.

Meropenem; Microdialysis; Sepsis rats; Recovery

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2017.03.009

国家自然科学基金青年项目(81301662) 北京市科技新星计划(Z161100004916165)

101500 北京，北京市密云区医院呼吸科1101500 北京，中国人民解放军火箭军总医院呼吸科2骨科3、药剂科4

王丹， Email：wdyy-618@sina.com

R563

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2016-03-10)