单晓枫，张海月，孙武文，康元环，陈 龙，张冬星，安鼎杰，田佳鑫，钱爱东

(吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春130118)

青虾源维氏气单胞菌胞外产物生物学特性及蛋白成分分析

单晓枫，张海月，孙武文，康元环，陈 龙，张冬星，安鼎杰，田佳鑫，钱爱东

(吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春130118)

为了研究维氏气单胞菌胞外产物在青虾感染中的致病作用以及维氏气单胞菌的致病机理，本试验以青虾源维氏气单胞菌QXF0711B为研究对象，提取其胞外产物，采用打孔法测定其胞外产物的酶活性，并对溶血活性进行溶血谱分析，同时分析其致病性。应用液相质谱与串联质谱相结合方法(LC-MSMS)对其胞外产物蛋白成分进行鉴定，利用Gene Ontology(GO)对已鉴定蛋白进行生物学过程、分子功能和细胞组分的分类分析。结果表明：QXF0711B菌株胞外产物具有淀粉酶活性、脂肪酶活性、蛋白酶活性和溶血活性，不具有明胶酶活性；其可溶解多种动物红细胞，尤以对鱼类红细胞溶血性更强，但对鸡、鸭红细胞无溶血活性。通过对菌株胞外产物蛋白成分分析显示有90种蛋白：共参与45种生物学过程，主要涉及碳水化合物代谢过程、运输等；共有46种分子功能，主要涉及DNA结合、ATP结合、金属离子结合等；为12种细胞组分，主要包括膜的有机组成、细胞质、细胞外膜等。

维氏气单胞菌 ； 胞外产物 ； 酶活 ； LC-MSMS ； GO分类分析

维氏气单胞菌是一种人、兽、水生动物共患病原菌[1]，其可以感染包括人在内的多种动物，患病动物多以出血性败血症、肠炎等为主要临床表征[2-4]。胞外产物(Ex tracellular products，ECP) 是细菌在生长过程中不断分泌到体外的、具有生物活性的蛋白酶类及毒素类物质。ECP能够降解宿主蛋白质、多糖、脂质等，并且破坏宿主的免疫系统，促进病原菌在宿主组织中进行繁殖，甚至直接作用于宿主的组织，使组织发生溶解和坏死。目前有关维氏气单胞菌胞外产物的研究在国内外鲜有报道，本试验以青虾源维氏气单胞菌胞外产物为研究材料，对其主要部分生物学特性及蛋白成分进行分析，为进一步了解维氏气单胞菌致病机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌种 青虾源维氏气单胞菌QXF0711B株，由浙江省淡水水产研究所潘晓艺副研究员惠赠。

1.2 试验动物 试验用斑马鱼，购自长春市某花鸟鱼市场，体重0.3～0.4 g，体长3.0～3.5 cm，暂养观察2周无异常后进行试验，试验前禁食24 h

1.3 维氏气单胞菌胞外产物(ECP)的制备 活化维氏气单胞菌菌株QXF0711B，接种于不含酚红的DMEM培养基，28 ℃ 180 r/min振荡培养36 h后收集培养物，12 000 r/min (4℃)离心30 min，收集上清液。经0.22 μmol/L微孔滤膜过滤除菌后，加入固体硫酸铵至75%饱和度，4 ℃静置过夜。12 000 r/min(4 ℃) 离心30 min，弃上清液，用0.02 mol/L Tris-HC1(pH值 7.4)缓冲液将沉淀重悬，经透析，聚乙二醇(PEG)10 000浓缩，得到胞外产物，然后涂于TSA固体平板，确定无菌后分装，-20 ℃保存备用。

1.4 胞外产物的酶活性及溶血性分析 在TSA固体培养基上分别添加可溶性淀粉(2%)、吐温80(1%)、脱脂牛奶(8%)、明胶(4%)和兔鲜血(7%)，用打孔法测定维氏气单胞菌ECP的淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、明胶酶酶活性以及溶血活性，并以不含酚红的DMEM培养基为阴性对照，30 ℃培养 24 h～48 h 后观察结果。

1.5 胞外产物溶血谱测定 参照Sahu I等[5]的方法略有改进。无菌采取青虾、鲫鱼、草鱼、鲤鱼、鲢鱼、鸡、鸭、兔、小鼠等动物红细胞，并制成2%红细胞悬液。胞外产物用无菌生理盐水在96孔板上倍比稀释，然后加入等量的2%红细胞，轻轻混匀，37 ℃(或28 ℃)温箱放置1 h，然后4 ℃冰箱过夜。试验设置2个对照组：对照组A为不加任何物质的红细胞稀释液，对照组B为100%溶血的红细胞悬液。结果判定标准以50%红细胞溶解的ECP最高稀释度为溶血价。

1.6 胞外产物致病性的测定 将190尾健康斑马鱼随机分成4组：试验Ⅰ组为纯维氏气单胞菌组、不含有ECP，试验Ⅱ组注射维氏气单胞菌胞外产物，试验Ⅲ组注射处理后的维氏气单胞菌菌体与胞外产物的混合物，对照组注射无菌PBS(具体情况见表1)，试验所有组所用斑马鱼腹腔注射10 μL/尾。感染后观察7 d，统计死亡数量。

1.7 胞外产物蛋白成分鉴定及GO功能分析 纯化菌株QXF0711B胞外产物，采用液相色谱与串联质谱相结合的方法(LC-MSMS)对胞外产物蛋白成分进行鉴定。通过Blast检索序列相似的模式生物蛋白，对鉴定到的蛋白进行GO功能分析(生物学过程、分子功能和细胞组分)，信息来自UNIPROT(http://www.uniprot.org)网站。

2 结果

2.1 胞外产物的酶活性及溶血性 提取维氏气单胞菌QXF0711B的胞外产物，测定其酶活性与溶血活性发现：淀粉平板加入卢戈氏碘液后加样孔周围出现透明环；吐温80平板加样孔周围出现了不透明的白色晕圈；脱脂牛奶平板加样孔周围出现了透明环；兔血培养基平板加样孔周围出现了无色透明环；明胶酶培养基平板加样孔周围无变化(见中插彩版图1)。结果表明，维氏气单胞菌QXF0711B株胞外产物具有淀粉酶活性、脂肪酶活性、蛋白酶活性以及对兔血具有溶血活性，不具有明胶酶活性。

2.2 胞外产物溶血谱测定结果 菌株QXF0711B胞外产物对鲤鱼的溶血价最高为26；其次为青虾、鲫鱼、鲢鱼和草鱼，溶血价均为25；乌鳢溶血价为24；对小鼠和兔溶血价分别为23、22；对鸡、鸭红细胞无溶血作用。

2.3 致病性结果 健康斑马鱼攻毒后均有不同程度的死亡现象产生，在试验Ⅰ组，当攻菌浓度为5.4×108CFU/mL时全部死亡；试验Ⅱ组ECP浓度0.56 mg/mL时死亡率为100%，0.28 mg/mL时死亡率为70%，且在攻毒后6 h即发生死亡；试验Ⅲ组具有较强的致病性，5.4×107CFU/mL的菌液混有0.28 mg/mL胞外产物时死亡率为100%，且攻毒后4 h即发生死亡，12 h时已死亡60%；PBS对照组没有出现死亡(表1)。2.4 质谱鉴定与蛋白功能分析 运用LC-MSMS方法分析维氏气单胞菌QXF0711B胞外产物，共检测出90种蛋白，其中有26种为功能未知蛋白，25种假定蛋白，其余蛋白分别为肽酶S8、铁转运蛋白、气单胞菌毒力因子、亮氨酸-tRNA连接酶、亚硫酸盐还原酶、氧化还原酶等。

根据所鉴定蛋白的GO注释信息，对其进行GO分类：其中参与生物学过程的蛋白有59种，这些生物学过程主要包括运输、DNA模板、碳水化合物代谢过程等；参与分子功能的蛋白共有80种，其中具有DNA结合、ATP结合、金属离子结合、受体活性功能的蛋白较多；参与细胞组分的蛋白共有41种，这些蛋白主要位于膜的有机组成、细胞质、细胞外膜等。

表1 QXF0711B菌株及其胞外产物致病性分析

3 讨论

本试验对青虾源维氏气单胞菌胞外产物的酶活性进行了初步分析。与目前已报道的维氏气单胞菌胞外产物酶活性存在差异[6]，具体原因可能与分离种类、菌株致病性等不同有关。因为病原菌产生的溶血活性可以导致各组织溶血现象的产生、蛋白酶具有分解胶原等蛋白成分的作用、淀粉能使糖原分解、脂肪酶可分解脂类，因此，当维氏气单胞菌感染青虾时，其分泌的ECP的溶血活性与酶活性导致青虾的各组织溶解，从而为细菌提供了营养物质。随着时间的延长，细菌增殖的同时酶量也随即增多，对青虾外壳、肌肉的破坏程度也不断增加，从而引起青虾的出现“软壳综合征”[3]。

维氏气单胞菌胞外产物可溶解多种动物的红细胞，但对不同动物的红细胞的敏感性存在差异，其溶血价也不同。邬向东[7]等发现鳝鱼源嗜水气单胞菌胞外产物，贺扬[6]等发现斑点鮰源维氏气单胞菌胞外产物对鱼类红细胞溶血价比对其他动物高，与本试验胞外产物对鱼类红细胞的溶血价比其他动物要高的结果相似。虽然试验菌株分离自青虾，但菌株ECP对鲤鱼红细胞溶血价要高于青虾，其原因可能是菌株在不同动物上致病机理有所区别有关，具体原因，需进行深入研究。

通过对致病性的分析发现，菌体与胞外产物混合感染斑马鱼时毒力最强，短时间内即发生死亡；单独感染胞外产物也即可导致斑马鱼的发病和死亡，死亡率也较高；但感染维氏气单胞菌菌体时，死亡数量开始较少，随着时间的延长，死亡数量呈递增趋势，其原因可能注射病原菌组不含有ECP，对鱼的致死性依赖于细菌在体内的增殖。

经过GO分类分析发现，蛋白具有较为广泛的生物学功能覆盖范围，从生物学过程中可以看出胞外产物参与调控的蛋白多是参与能量代谢相关途径，如碳水化合物代谢等。细胞组分分析发现，这些蛋白更多定位于生命活动的主要场所膜的有机组成、细胞质和细胞外膜。分子功能分析表明，这些蛋白的功能集中在DNA结合、ATP结合以及金属离子结合等。

[1] 单晓枫，康元环，夏京津，等.不同动物源性维氏气单胞菌生物学特性比较研究[J].中国兽医杂志，2015，51(3)：82-85.

[2] 李伟杰，赵耘，刘燕，等.狐狸源致病性维氏气单胞菌的分离鉴定及耐药性分析[J].中国预防兽医学报，2012，34(4)：289-292.

[3] 潘晓艺，沈锦玉，李建应，等.青虾 “软壳综合症” 病原及其特性[J].微生物学通报，2009，36(10)：1 571-1 576.

[4] Rahman M，Colque-Navarro P，Kühn I，etal.Identification and characterization of pathogenicAeromonasveroniibiovarsobriaassociated with epizootic ulcerative syndrome in fish in Bangladesh[J].Applied and environmental microbiology，2002，68(2)：650-655.

[5] Sahu I，Das B K，Marhual N，etal.Toxicity of crude extracellular products ofAeromonashydrophilaon rohu，Labeo rohita(Ham.)[J].Indian journal of microbiology，2011，51(4)：515-520.

[6] 贺扬，华丽，汪开毓，等.高致病性维氏气单胞菌胞外产物对斑点鮰的致病性[J].水产学报，2016，40(3)：457-467.

[7] 邬向东，何后军，周秋白，等.鳝鱼嗜水气单胞菌外毒素的分离纯化及活性研究[J].经济动物学报，2008，12(1)：38-41.

Bioactivity Analysis of extracellular products ofAeromonasveroniistrain isolated from Freshwater Shrimp

SHAN Xiao-feng，ZHANG Hai-yue，SUN Wu-wen, KANG Yuan-huan ，CHEN Long，ZHANG Dong-xing，AN Ding-jie，TIAN Jia-xin，QIAN Ai-dong

(College of Animal Science and Technology， Jilin Agricultural University， Changchun 130118， China)

In order to study the pathogenic role of extracellular products(ECP) and pathogenic mechanism ofAeromonasveroniiisolated from freshwater shrimp,the extracellular products fromAeromonasveroniiQXF0711B were extracted，and the enzyme activity and hemolytic activity of extracellular products were determined by plat stiletto method.LC-MSMS and Gene Ontology method were used to identify the protein components of the extracellular products and analyzing the biological process，molecular function and cellular components of ECP，respectively.Biologic activities showed that the ECP possess amylase and lipase activity，protease and hemolytic activity，but no gelatinase activity.The hemolytic effect of ECP showed a high hemolytic activity to fish erythrocyte，while no hemolytic activity to chicken and duck erythrocyte.The component analysis showed that 90 kinds of proteins were detected in the extracellular products.These proteins involved in 45 kinds of biological processes，especially carbohydrate metabolism process and transport，46 kinds of molecular functions about DNA binding，ATP binding and metal ion binding mainly，and 12 kinds of cellular components including integral component of membrane，cytoplasm and cell outer membrane.

Aeromonasveronii; extracellular products; enzyme activity; LC-MSMS; GO classification analysis

QIAN Ai-dong

2016-09-23

国家自然科学基金项目(31201927)；吉林省科技厅重点科技攻关项目(20150204065NY)

单晓枫(1977-)，男，副教授，博士，从事动物细菌学方面的研究，E-mail：sxf1997@163.com

张海月(1990-)，女，博士生，主要从事分子细菌学研究，E-mail：748436536@qq.com

钱爱东，E-mail：qianaidong0115@163.com

S945.4

A

0529-6005(2017)04-0105-03

注：张海月与单晓枫对本文具有同等贡献