关 皎，朱鹤云，李海鹏，董 颖，郝乘仪，王黎明，冯 波

(1.吉林医药学院药学院，吉林吉林132013; 2.宁夏回族自治区药品审评认证中心宁夏银川750001)

回流法与闪式提取法提取泽泻中23-乙酰泽泻醇B的工艺对比研究

关 皎1，朱鹤云1，李海鹏1，董 颖2，郝乘仪1，王黎明1，冯 波1

(1.吉林医药学院药学院，吉林吉林132013; 2.宁夏回族自治区药品审评认证中心宁夏银川750001)

为了对比研究回流提取法与闪式提取法提取泽泻中23-乙酰泽泻醇B的工艺，采用超快速液相色谱法测定泽泻中23-乙酰泽泻醇B的含量，回流法和闪式提取法均以乙醇浓度、提取时间、料液比为考察因素，以泽泻中23-乙酰泽泻醇B的含量为考察指标，采用 L9(34) 正交试验优选出最佳提取工艺。结果回流提取法的最佳提取工艺：提取溶剂为95%乙醇，提取时间为2 h，料液比为1∶50；闪式提取法的最佳提取工艺：提取溶剂为95%乙醇，提取时间为1 min，料液比为1∶60。表明闪式提取法所得泽泻中23-乙酰泽泻醇B含量高于回流提取法。闪式提取法的操作简单、耗时短、提取率高、节省能源，可为泽泻药材的新药开发和工业化生产提供依据，同时为新兽药开发利用提供参考。

泽泻 ； 23-乙酰泽泻醇B ； 超快速液相色谱法 ； 闪式提取法 ； 回流提取法

泽泻为泽泻科植物泽泻Alismaorientale(Sam.) Juzep.的干燥块茎。性寒、味甘、归肾、膀胱经、具有利水渗湿、泄热、化浊降脂的功效，可用于小便不利、水肿胀满、泄泻尿少、痰饮眩晕、热淋涩痛、高脂血症等[1]。主产于福建、四川等地。泽泻主要含有三萜、二萜类、倍半萜成分[2-4]。现代药理研究表明，泽泻具有抑制肾结石形成、降血压、抗动脉粥样硬化、降血糖、降血脂、免疫调节、抗肿瘤等多种生物活性[5-7]。23-乙酰泽泻醇B为泽泻中的主要二萜类活性成分，中国药典2015版将其用于泽泻药材鉴别和含量测定[1]。目前，文献报道的泽泻中23-乙酰泽泻醇B的提取方法多为回流提取法[8-13]和超声法[11-13]。本研究将一种新的提取方法-闪式提取法应用于提取泽泻中23-乙酰泽泻醇B，采用正交试验设计优选泽泻中23-乙酰泽泻醇B提取的工艺参数，并将其与回流法进行比较，为更加深入的研究泽泻药材的质量标准和新药开发提供试验依据，有利于将泽泻的药用价值充分应用于兽药行业，为天然药物应用于兽药领域提供参考。

1 仪器与试药

Prominence UFLC型超快速液相色谱仪(配备Prominence SIL-20AHT自动进样器，LC-20AD二元泵，CTO-20A柱温箱，SPD-20A紫外检测器，LC solution色谱工作站，日本岛津公司)；KQ-250DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；TG16KR台式高速冷冻离心机(长沙东旺实验仪器有限公司)；CPA 225D型电子天平(德国赛多利斯仪有限公司)。

乙腈为色谱纯(美国Fisher科技)，所用水为经过Milli-Q型超纯水仪净化后的超纯水，其他试剂均为分析纯。对照品23-乙酰泽泻醇B(批号：111846-201504)，购自中国食品药品检定研究院，纯度大于98 %。

泽泻药材，购自吉林市吉林大药房(盐泽泻)，产地四川，经吉林医药学院生药教研室李景华副教授鉴定为泽泻科植物泽泻Alismaorientale(Sam.)Juzep.的干燥块茎，样本留存于吉林医药学院药学院中药样品室。

2 方法与结果

2.1 23-乙酰泽泻醇B的含量测定。

2.1.1 色谱条件 采用Shim-Pack XR-ODS柱(75 mm×3.0 mm, 2.2 μm)；流动相为乙腈-水(80∶20)；流速为0.4 mL/min；检测波长为208 nm；柱温为30 °C；进样量5 μL ，色谱图见图1。

2.1.2 标准曲线的制备 精密称取对照品泽泻中23-乙酰泽泻醇B适量，用乙腈配成浓度为 0.1 mg/mL 对照品溶液，分别精密吸取对照品溶液0.1，0.25，0.5，1.0，2.0 mL，置于5 mL量瓶中，用乙腈-水(80∶20)定容至刻度，依次注入超快速液相色谱仪，测定色谱峰面积，以样品色谱峰面积(Y)为纵坐标，浓度(X)为横坐标，进行线性回归，23-乙酰泽泻醇B的回归方程为：Y= 2.195×104X+9.30×103,R= 0.9999 结果表明，23-乙酰泽泻醇B浓度在2-40 μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.1.3 精密度试验 分别精密吸取“2.1.2”项下制备的第3个对照品溶液5 μL，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，测定峰面积。结果，RSD(n=6)为0.3%，表明仪器精密度良好。

图1 对照品(A)和样品(B)色谱图

2.1.4 稳定性试验 取同一批次的供试品溶液，放置于室温，分别于0，2，4，8，12，24 h进样测定，测定峰面积。结果RSD为1.7%，表明供试品溶液在24 h 内稳定。

2.1.5 重复性试验 取同一批泽泻样品6份，精密称定，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，进样5 μL，计算23-乙酰泽泻醇B的含量，结果RSD为2.7%，表明方法重复性良好。

2.1.6 回收率试验 精密称取已知含量(23-乙酰泽泻醇B含量分别为0.074 %)的泽泻样品粉末9份，每份0.25 g，精密称定，分别加入相当于样品中23-乙酰泽泻醇B含有量的80%，100%，120%的对照品溶液适量，各3份。按“2.1.7”项下的方法制备供试品溶液，进样5 μL，结果23-乙酰泽泻醇B的平均回收率为98.9 %。

2.1.7 供试品的测定 取泽泻药材粉末(过40目筛)约0.5g，精密称定，置50 mL具塞锥形瓶中，加入乙腈25mL，称定重量，超声(250 W，40 kHz)提取30 min，放冷后再称重，用乙腈补足减失的重量，摇匀、滤过。精密量取续滤液4mL，蒸干，残渣用乙腈-水(80∶20)4 mL溶解后转移至离心管中，摇匀，离心，取上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤后作为供试品溶液。精密吸取供试品溶液5 μL，按“2.1.1”项下色谱条件进行 HPLC 分析。

2.2 回流提取法提取泽泻中23-乙酰泽泻醇B

2.2.1 正交试验设计 以单因素试验结果为参考，选择乙醇浓度(A)、提取时间(B)、料液比(C)3个因素，以泽泻中23-乙酰泽泻醇B含量为考察指标，采用L9(34)正交设计表安排试验，因素水平见表1，正交试验结果见表2，方差分析结果见表3。

表1 回流法因素水平

表2 正交试验结果

表3 方差分析结果

由表3可知，以23-乙酰泽泻醇含量(%)为检测指标，各因素影响顺序为 A>C>B，乙醇浓度对提取工艺有较大的影响。优化出回流法提取泽泻中23-乙酰泽泻醇B最佳方案为A3B3C2，即提取溶剂为95%乙醇，提取时间为2 h，料液比为1∶50。

2.2.2 验证试验 取供试品3份，按照优化工艺条件，重复3次试验进行验证，结果23-乙酰泽泻醇B的含量(%)平均为0.143%，比正交试验中最高提取率(0.108%)高，表明试验所确定的工艺条件为回流法最佳工艺条件。

2.3 闪式提取法提取泽泻中23-乙酰泽泻醇B

2.3.1 正交试验设计 以单因素试验结果为参考，选择乙醇浓度(B)、提取时间(C)、料液比(D)3个因素，以泽泻中23-乙酰泽泻醇B含量为考察指标，采用L9(34)正交设计表安排试验，因素水平见表4，正交试验结果见表5，方差分析结果见表6。

表4 闪式提取法因素水平

表5 正交试验结果

表6 方差分析结果

由表6可知，以23-乙酰泽泻醇含量(%)为检测指标，各因素影响顺序为 C>B>A，料液比对提取工艺有较大的影响。优化出回流法提取泽泻中23-乙酰泽泻醇B最佳方案为 A3B1C3，即提取溶剂为95%乙醇，提取时间为1 min，料液比为1∶60。

2.3.2 验证试验 取供试品3份，按照优化工艺条件，重复3次试验进行验证，结果23-乙酰泽泻醇B的含量(%)平均为 0.309%，比正交试验中最高提取率(0.247%)高，表明试验所确定的工艺条件为回流法最佳工艺条件。

2.4 回流法与闪式提取法提取效果对比 以不同方法提取泽泻中23-乙酰泽泻醇B的条件及含量对比见表7。由表7可知，闪式提取法提取时间仅为回流法的 1/120，并且含量比回流的含量高，因而闪式提取法更加省时、高效。

表7 闪式提取与回流提取结果比较

3 讨论

闪式提取器是根据组织破碎原理科学设计而成的一种新型提取器，对含不同类型化学成分的中草药进行了研究，取得了较好的效果。闪式提取器的原理可总结为：快速破碎、超速动态分子渗透作用、剧烈搅拌、强力振动作用。闪式提取法有省时、省力、操作简单等优点可为泽泻药材中有效成分的提取工艺研究提供新的方法。目前已有很多文献对回流法和超声法提取泽泻中23-乙酰泽泻醇B的提取工艺进行比较[11-13]，但对于闪式提取法提取泽泻中23-乙酰泽泻醇B的提取工艺的研究较少。本研究把闪式提取法应用于泽泻中23-乙酰泽泻醇B的提取工艺中，以泽泻中23-乙酰泽泻醇B含量为指标，并对回流提取法和闪式提取法提取泽泻中23-乙酰泽泻醇B的提取工艺进行比较，得出的最佳提取工艺为闪式提取法提取泽泻中23-乙酰泽泻醇B：提取溶剂为 95%乙醇，提取时间为 1 min，料液比为 1∶60。结果表明，闪式提取法比回流提取法提取泽泻中23-乙酰泽泻醇B的提取率更高，且操作简单，提取时间短，具有明显的优势。

[1] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典: 2015 年版一部[S]. 北京: 中国医药科技出版社, 2015: 229.

[2] 胡雪艳，陈海霞，高文远，等. 泽泻化学成分的研究[J]. 中草药，2008, 39 (12): 1788-1790.

[3] 肖飞艳，冯育林，杨世林，等. 泽泻化学成分的研究进展[J]. 中药新药与临床药理，2009, 20 (5): 491-495.

[4] 许文，罗奋熔，赵万里，等. 泽泻降糖活性提取物化学成分研究[J]. 中草药，2014, 45 (22): 3238-3245.

[5] 李淑子，金在久，张善玉. 泽泻不同提取物对高脂血症小鼠血脂及脂质过氧化的影响[J]. 中国实用医药，2008, 3(32): 7-9.

[6] 张朝凤，周爱存，张勉，等. 泽泻的化学成分及其免疫抑制活性筛选[J]. 中国新药杂志，2009, 34(8): 994-998.

[7] 刘妙娜，贺战梅，张立冬，等. 泽泻防治泌尿系结石有效部位提取工艺研究[J]. 医药导报,2009,28(10):1329-1331.

[8] 王建平，傅旭春，白海波. 泽泻降血尿酸乙醇提取物的提取工艺研究[J]. 中国中药杂志，2010, 14(35): 1809-1811.

[9] 许锋，彭松，尹强，等. 正交试验法优选人参和泽泻的混合提取工艺研究[J]. 湖北中医杂志，2007, 29(5): 49-50.

[10] 周本杰，莫轩辉. 泽泻降脂有效部位提取工艺的筛选研究[J]. 中国药房，2006, 17(2): 103-105.

[11] 杨锋，赵汉臣，闫荟，等. 23-乙酰泽泻醇B 4种提取方法比较[J]. 中国药房，2007, 18(6): 429-430.

[12] 邓迎娜，易醒，肖小年，等. 超声提取泽泻中三萜类总组分[J]. 食品工业科技，2007, 28(9):145-147.

[13] 何舒澜. 泽泻中泽泻醇B-23乙酸酯两种提取工艺的比较与优化[J]. 海峡药学，2009, 21(3):24-25.

Comparison of reflux and smashing tissue extraction process of Alisol B-23-acetate fromAlismatisRhizoma

GUAN Jiao1, ZHU He-yun1, LI Hai-peng1, DONG Ying2, HAO Cheng-yi1，WANG Li-ming1, FENG Bo1

(1.School of Pharmacy , Jilin Medical University , Jilin 132013 ，China；2.Center for certification & Evaluation of Ning Xia Hui Autonomous Region, Yinchuan 750001,China)

To compare the reflux extraction process and smashing tissue extraction process of Alisol B-23-acetate inAlismatisRhizoma. Alisol B-23-acetate was determined by an ultra-fast liquid chromatography (UFLC) method.The best extraction technology was optimized by L9(34) orthogonal experimental design with ethanol concentration, extraction time, material-liquid ratio as factors and with the content of Alisol B-23-acetateasindex. The optimal Reflux Extraction process was as follows: extraction solvent of 95% ethanol, extraction time of 2 h, and material-liquid ratio of 1∶50. The optimal smashing tissue extraction process was as follows: extraction solvent of 95% ethanol, extraction time of 1 h, and material-liquid ratio of 1∶60.The content of Alisol B-23-acetate inAlismatisRhizomaby Smashing tissue extraction was higher than that in Reflux Extraction. The Smashing tissue extraction was simple, short time with high extraction rate and less energy, Which could provide the basis for the new drug development and industrial production ofAlismatisRhizoma.

AlismatisRhizoma; Alisol B-23-acetate; UFLC; Smashing tissue extraction process; Reflux extraction process

FENG Bo

2016-12-02

吉林省卫生厅科研课题(2013Z008)；吉林省中医药管理局科研课题(2015Z726)

关皎(1983-)，女，讲师，博士，研究方向为中药质量控制及药代动力学，Email：rainbowguanjiao@sina.com

冯波，E-mail：fengbo2@sina.com

R284.2

A

0529-6005 (2017)04-0095-04