任向阳 , 吴文福 , 岑小清，游启有 , 刘秋燕，赖月辉，黄秋雪

(1.广东永顺生物制药股份有限公司，广东广州511356 ； 2.广州出入境检验检疫局，广东广州510623)

猪瘟活疫苗(传代细胞源)免疫产生期和免疫持续期试验

任向阳1，2, 吴文福1, 岑小清1，游启有1, 刘秋燕1，赖月辉1，黄秋雪1

(1.广东永顺生物制药股份有限公司，广东广州511356 ； 2.广州出入境检验检疫局，广东广州510623)

将三批猪瘟活疫苗(传代细胞源)以单剂量分别接种仔猪进行免疫产生期试验。在免疫同时以及免后1、2、3、4、5日连同对照组分别攻击猪瘟强毒，攻毒后观察16天，结果表明，猪瘟活疫苗(传代细胞源)免后4日即可产生坚强的免疫保护力。将三批猪瘟活疫苗(传代细胞源)以单剂量分别接种仔猪进行免疫持续期试验。在免后3个月、6个月、9个月、12个月、15个月连同对照组分别攻击猪瘟强毒，攻毒后观察16天，结果表明，猪瘟活疫苗(传代细胞源)的免疫持续期可长达15个月。

猪瘟活疫苗(传代细胞源) ； 免疫产生期 ； 免疫持续期

猪瘟是一种急性、热性和高度接触传染的病毒性传染病。其特征为发病急、高热稽留和细小血管变性，引发全身泛发型小点出血，脾梗死。急性猪瘟由强毒引起，发病率和死亡率较高；弱毒感染不表现临床症状则可能不被觉察。不同品种、性别、年龄的猪均易感，猪瘟严重危害我国养猪业并造成巨大的经济损失。免疫接种是预防和控制该病流行和发生的主要措施。猪瘟疫苗的质量好坏，直接影响猪瘟的免疫效果。利用牛睾丸细胞和兔脾淋组织生产的猪瘟活疫苗病毒含量低，制造工艺落后，效价标准低，在当前疫病复杂等因素影响下很难达到理想的免疫效果。利用猪睾丸传代细胞系生产的猪瘟活疫苗(传代细胞源)在生产工艺、病毒含量、纯净性和质量稳定性等方面获得重大突破[1-3]。本试验对猪瘟活疫苗(传代细胞源)的免疫产生期和免疫持续期进行研究，现将试验方法和结果报告如下。

1 材料

1.1 试验用疫苗 猪瘟活疫苗(传代细胞源)三批，分别记录为：疫苗1、疫苗2、疫苗3。由广东永顺生物制药股份有限公司生产，并按照《猪瘟活疫苗(传代细胞源)质量标准》中检验方法进行检验，所有检验结果均合格。

1.2 试验用仔猪 来源于广东永顺生物制药股份有限公司实验动物场自繁自养的CSFV、PRV、PRRSV、PCV2、PPV抗原阴性、未接种过CSF疫苗的二元杂交仔猪。经猪瘟病毒中和试验方法[8]检测，选择猪瘟病毒中和抗体阴性的健康易感猪(25～30日龄)。

1.3 攻毒用强毒 猪瘟强毒石门系血毒，由广东永顺生物制药股份有限公司制备、鉴定和保存。

1.4 猪瘟病毒抗体ELISA检测试剂盒(阻断ELISA) 购自IDEXX公司。

2 方法

2.1 免疫产生期试验

2.1.1 仔猪的筛选与分组 经猪瘟病毒中和试验方法筛选猪瘟病毒中和抗体阴性的25～30日龄仔猪，无论是否同窝，均需逐头检测。选取95头猪瘟病毒中和抗体阴性仔猪。随机分为19组，其中18组为免疫组，每组5头共90头；另外1组为对照组5头。

2.1.2 免疫攻毒 将3批猪瘟活疫苗(传代细胞源)按标签注明头份分别稀释成1头份/mL，耳后颈部肌肉注射，每头注射1.0 mL。做好标记，分开饲养。免疫同时以及免后1、2、3、4、5日(即攻毒同时以及攻毒前1、2、3、4、5日免疫)连同5头条件相同的非免疫对照仔猪分别攻击猪瘟强毒，耳后颈部肌肉注射，每头注射猪瘟强毒石门系血毒1.0 mL(105MLD/mL)。攻毒后每天观察临床症状，每天上、下午各测体温1次，连续观察16日，并统计分析攻毒结果。免疫产生期试验分组情况见表1。

表1 3批猪瘟活疫苗(传代细胞源)免疫产生期试验分组

2.1.3 猪瘟病毒抗体水平的监测 将各试验组分别于免疫前和攻毒前抽取血样，分离血清，以阻断ELISA方法测定其猪瘟病毒抗体水平，分析试验组在不同时期免疫攻毒保护试验中的抗体水平。猪瘟病毒抗体检测操作方法和判定标准按照IDEXX-ELISA试剂盒使用说明书进行。

2.2 免疫持续期试验

2.2.1 仔猪的筛选与分组 经猪瘟病毒中和试验方法筛选猪瘟病毒中和抗体阴性的25～30日龄仔猪，无论是否同窝，均需逐头检测。选取100头猪瘟病毒中和抗体阴性仔猪。随机分为20组，其中15组为免疫组，每组5头共75头；另外5组为对照组，每组5头共25头。

2.2.2 免疫攻毒 将3批猪瘟活疫苗(传代细胞源)按标签注明头份分别稀释成1头份/mL，每批疫苗分别注射25头仔猪，耳后颈部肌肉注射，每头注射1.0 mL。做好标记，分开饲养。免疫后3、6、9、12、15个月于每批疫苗的免疫组中随机抽取5头，连同5头条件相同的非免疫对照仔猪分别攻击猪瘟强毒，耳后颈部肌肉注射，每头注射猪瘟强毒石门系血毒1.0ml(105MLD/mL)。攻毒后每天观察临床症状，每天上、下午各测体温1次，连续观察16天，并统计分析攻毒结果。免疫持续期试验分组情况见表2。

表2 3批猪瘟活疫苗(传代细胞源)免疫持续期试验分组

2.2.3 猪瘟病毒抗体水平的监测 分别在免前和免后3、6、9、12、15个月进行猪瘟病毒抗体检测。抽取血样，分离血清，以阻断ELISA方法测定其猪瘟病毒抗体水平，分析试验组在不同时期的抗体水平。猪瘟病毒抗体检测操作方法和判定标准按照IDEXX-ELISA试剂盒使用书进行。

3 结果与分析

3.1 免疫产生期试验结果

3.1.1 免疫攻毒试验结果 将三批猪瘟活疫苗(传代细胞源)以单剂量免疫仔猪进行免疫产生期试验，试验结果见表3。根据试验结果可知，3批猪瘟活疫苗(传代细胞源)免疫同时以及免后1日、2日攻击猪瘟强毒的仔猪均出现典型的猪瘟临床症状；免后3日对仔猪的保护率为60%～80% (3/5～4/5)，免后4日、5日攻击猪瘟强毒的仔猪既无体温升高，也无猪瘟临床症状，全部健活。对照猪全部发病，均呈典型的猪瘟临床症状，在观察16日内有3头死亡，剖检可见猪瘟特征性病变。

3.1.2 猪瘟病毒抗体水平的监测结果 各试验组和对照组分别于免前和攻毒前均抽取血样，分离血清，以阻断ELISA方法测定其猪瘟病毒抗体水平，试验结果显示，各组的样品阻断率均不大于30%，判断为阴性(无猪瘟病毒抗体存在)。

表3 3批猪瘟活疫苗(传代细胞源)免疫产生期试验结果

3.2 免疫持续期试验结果

3.2.1 免疫攻毒试验结果 将3批猪瘟活疫苗(传代细胞源)以单剂量免疫仔猪进行免疫持续期试验，猪只接种后观察14日，接种部位均无肿块出现，未见任何不良反应。免疫持续期试验结果见表4。根据试验结果可知，3批猪瘟活疫苗(传代细胞源)免后3、6、9、12、15个月分别攻击猪瘟强毒对猪的保护率均为100%(5/5)。对照猪全部发病，均呈典型的猪瘟临床症状，且每组对照组均有3头以上死亡，剖检可见猪瘟特征性病变。

表4 3批猪瘟活疫苗(传代细胞源)免疫持续期试验结果

3.2.2 猪瘟病毒抗体水平的监测结果 分别在免前和免后3、6、9、12、15个月进行猪瘟病毒抗体检测。试验结果见图1。根据试验结果可知，三批猪瘟活疫苗(传代细胞源)以单剂量免疫仔猪，至免疫后15个月，仍维持在理想的水平。

血清抗体变化图

图1 3批猪瘟活疫苗(传代细胞源)免后不同时期的猪瘟抗体水平(抗体平均值)

4 结论

4.1 猪瘟活疫苗(传代细胞源)免疫接种属于人工主动免疫。疫苗免疫之后动物机体需要一定的时间来进行抗原的识别和递呈，动物机体免疫系统受到抗原刺激后则产生体液免疫和细胞免疫应答从而保护动物免受疫病干扰。从疫苗免疫到获得坚强保护力的时间为非免疫保护期，即为免疫空白期，免疫空白期在任何动物上都不可避免，但免疫空白期越短动物越安全，反之越危险[4]。从猪瘟活疫苗(传代细胞源)的免疫产生期试验结果可知，猪瘟活疫苗(传代细胞源)免疫4日后即可产生坚强的免疫保护力，证明猪瘟兔化弱毒株是非常优秀的疫苗株，尽管如此免疫后2日内依然无法抵抗猪瘟野毒的感染导致发病或死亡，免疫后3日只能提供部分保护，说明猪瘟活疫苗免后存在2～3日的免疫空白期，在此期间要特别注意猪群免受猪瘟野毒感染；免前至免后5日各试验组和对照组的猪瘟病毒抗体监测结果均为阴性，但免后4日和免后5日免疫猪对猪瘟强毒已经产生坚强的保护力，说明体液免疫相对细胞免疫出现较晚，在免疫初期细胞免疫发挥了重要作用。

4.2 从猪瘟活疫苗(传代细胞源)的免疫持续期试验结果可知，至免疫后15个月，猪瘟活疫苗(传代细胞源)的免疫保护率仍为100%(5/5)。根据猪瘟病毒抗体监测结果可知，猪瘟体液免疫应答相对细胞免疫应答出现较晚，但猪瘟体液免疫应答出现后则维持时间较长，免疫后15个月猪瘟病毒抗体仍维持在理想水平。从猪瘟强毒攻击后的免疫保护率和猪瘟病毒抗体的变化规律两方面综合判断，免后15个月，猪瘟活疫苗(传代细胞源)对猪仍可提供坚强的保护力，免疫效果确切。

4.3 在实验室条件下，断奶后无母源抗体的仔猪，注射猪瘟活疫苗(传代细胞源)1头份可为猪提供15个月的免疫保护。但在猪场实际使用中会遇到如猪瘟母源抗体干扰、其他病原混合感染等诸多问题[5]。因此，在生产实际中可进行两次免疫，仔猪可于出生后25～35日龄和60日龄左右各注射1次，1头份/头，确保猪瘟活疫苗(传代细胞源)的免疫效果。

[1] 吴文福，岑小清，任向阳，等.猪瘟兔化弱毒疫苗的研制概况[J].广东畜牧兽医科技，2009，34(6)：6-8.

[2] 张毓金，林旭埜，吴文福，等.猪瘟活疫苗(传代细胞源)免疫猪的攻毒保护试验[J].中国兽医杂志，2014，50(3)：28-30.

[3] 孙彦伟，查云峰，田云，等.三个厂家猪瘟活疫苗(传代细胞源)免疫效果比较试验[J].广东畜牧兽医科技，2012，37(2)：29-32.

[4] 南文金，黄健强，黄鸿惠，等.某规模化猪场猪瘟抗体水平的检测[J].动物医学进展，2016，37(3)：120-123.

[5] 原霖，顾晓雪，张硕，等.规模化猪场猪瘟免疫失败调查及免疫程序优化[J].中国兽医杂志，2013，49(7)：27-29.

The Onset Time and Maintenance Phase of Immunity Protection for Classical Swine Fever Live Vaccine(Cell Line Origin)

REN Xiang-yang1，2，WU Wen-fu1，CEN Xiao-qing1，YOU Qi-you1，LIU Qiu-yan1，LAI Yue-hui1，HUANG Qiu-xue1

(1.Guangdong Win-sun Pharmaceytical Stock Limited Company,Guangzhou 511356, China；2.Guangzhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Guangzhou 510623, China)

To evaluate the onset time of immunie protection for Classical Swine Fever Live Vaccine (Cell Line Origin),the piglets together with the control group were injected with strong CSFV 0，1，2，3，4 and 5 days post the inoculation of each batch of the total 3 batches of Vaccine for a single dose. It was observed for 16days after injection with strong CSFV. The results showed that day 4 was the onset time of immunie protection for Classical Swine Fever Live Vaccine (Cell Line Origin).To evaluate the maintenance phase of immune protection for Classical Swine Fever LiveVaccine (Cell Line Origin), the piglets together with the control group were injected with strong CSFV on Months 3，6，9，12 and 15 post the inoculation of each batch of the total 3 batchesof Vaccine for a single dose. It was observed for 16 days after the injection with strong CSFV. The results showed the maintenance phase of immunity protection for Classical Swine Fever Live Vaccine lasted at least 15months(Cell Line Origin).

Classical Swine Fever Live Vaccine (Cell Line Origin)； The Onset Time of Immunity Protection； The Maintenance Phase of Immunity Protection

WU Wen-fu

2016-11-16

任向阳(1981-)，男，兽医师，硕士，从事兽用生物制品研发与管理工作，E-mail: 1046253137@qq.com

吴文福，E-mail: wuwf18@163.com

S858.23

A

0529-6005(2017)04-0092-03