张玉洁，李 丹，李 倩，王鹤佳

(中国兽医药品监察所，北京海淀100081)

奶及奶粉中4种阿维菌素类药物残留检测高效液相色谱法

张玉洁，李 丹，李 倩，王鹤佳

(中国兽医药品监察所，北京海淀100081)

建立一种适用于牛奶、羊奶和奶粉中乙酰氨基阿维菌素、阿维菌素、伊维菌素和多拉菌素的残留检测方法。奶及奶粉中的4种阿维菌素类药物用20%乙醇乙腈溶液提取，加水和微量三乙胺稀释后经C18固相萃取柱净化，氮气吹干后，65 ℃避光衍生化反应15 min。用高效液相色谱—荧光检测法分析，外标法定量。4种药物在0.5～1 000 ng/mL浓度范围内线性关系良好，在牛奶、羊奶中的定量限为0.5 μg/kg；在奶粉中的定量限为5 μg/kg。一定浓度范围内，4种药物在牛奶、羊奶和奶粉中的平均回收率为89.2%～113%；批内变异系数为0.450%～9.73%，批间变异系数为2.90%～10.6%。该方法操作简单、灵敏度高、准确度和精密度好，适用于牛奶、羊奶及奶粉中阿维菌素类药物的残留检测。

阿维菌素类 ； 奶 ； 奶粉 ； 高效液相色谱法

阿维菌素类药物是目前应用范围最广的抗寄生虫药。由于具有较高的脂溶性，阿维菌素和伊维菌素可经乳腺排泄，脂溶性较高的多拉菌素在体内消除缓慢，乙酰氨基阿维菌素极性稍高，乳中浓度较低，可用于防治包括奶牛在内的所有种类牛寄生虫病[1,2]。阿维菌素类药物对哺乳动物的毒性很低，但是长期食用含有此类药物的奶产品会对人类健康产生潜在威胁。我国农业部于2002年发布的第235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》中规定阿维菌素禁用于泌乳期牛、羊，多拉菌素禁用于泌乳期牛，伊维菌素在牛奶中的最高残留限量为10 μg/kg[3]。

阿维菌素类药物分子量大，主要采用高效液相色谱法进行分析。但目前该类药物的多残留检测方法多集中于对猪、牛、羊等动物组织样品中的残留分析研究，而有关牛奶、羊奶及奶粉中残留检测的报道较少，尤其是针对羊奶及奶粉的检测方法，鲜有报道[1,4-5]。现行的两个标准方法也存在适用组织不全面以及方法的灵敏度较低的问题[6-7]。因此，本试验制订了4种阿维菌素类药物针对牛奶、羊奶和奶粉的检测方法，并降低了定量限及检测限，以便更好地满足实际检测工作的需求。

1 材料与方法

1.1 仪器设备、试剂及对照品 Agilent 1100高效液相色谱仪(配荧光检测器)；SPE柱：Bond Elut C18固相萃取柱(500 mg/6 mL)，或相当者；固相萃取装置；氮吹仪；高速冷冻离心机；Milli-Q超纯水仪等。

阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素和乙酰氨基阿维菌素对照品，纯度≥91.0%，由中国兽医药品监察所提供。甲醇、乙腈、无水乙醇为色谱纯，异辛烷、三乙胺为分析纯。试验用水为符合GB/T 6682-2008的一级水。

1.2 溶液配制 20%乙醇乙腈溶液：取无水乙醇20 mL用乙腈稀释至100 mL。固相萃取柱洗涤液：取乙腈30 mL、水70 mL和三乙胺20 μL，混匀。衍生化试剂A液：N-甲基咪唑-乙腈(1+1，v/v)。B液：三氟乙酸酐-乙腈(1+2，v/v)。均现用现配。

阿维菌素类药物混合标准储备液(1 mg/mL)：分别称取乙酰氨基阿维菌素、阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素标准品约10 mg，精密称定于10 mL量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度。配制成浓度为 1 mg/mL 混合标准储备液，-20 ℃保存，有效期6个月。

阿维菌素类药物混合标准工作液(10 μg/mL)：准确量取混合标准储备液0.25 mL于25 mL量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，配制成浓度为 10 μg/mL 混合标准工作液。-20 ℃保存，有效期3个月。

阿维菌素类药物混合标准工作液(1 μg/mL)：准确量取10 μg/mL阿维菌素类药物混合标准工作液2.5 mL于25 mL量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，配制成浓度为1 μg/mL 混合标准工作液。-20 ℃ 保存，有效期3个月。

1.3 试验方法

1.3.1 液相色谱条件 色谱柱: C18250 mm×4.6 mm (i. d)，粒径5 μm；流动相:乙腈：水(90∶10,V/V)；流速: 1.8 mL/min；检测波长:激发波长365 nm；发射波长475 nm；柱温：40 ℃；进样量: 40 μL。

1.3.2 标准曲线及线性范围的测定 精密量取100 ng/mL阿维菌素类药物混合标准工作液0.15、0.5 mL于10 mL量瓶中，用乙腈稀释至刻度；精密量取1 μg/mL阿维菌素类药物混合标准工作液0.5、1、2.5、5.0 mL至10 mL量瓶中，用乙腈稀释至刻度，配制成浓度分别为1.5、5、50、100、250、500 ng/mL乙酰氨基阿维菌素、阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素混合标准溶液。取上述6个浓度及1 μg/mL标准工作液各1.0 mL于各自的10 mL试管中，于50 ℃水浴氮气吹干，按衍生化步骤处理后供高效液相色谱测定。以测得峰面积为纵坐标，对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。求回归方程和相关系数。

1.3.3 样品前处理 称取牛奶、羊奶(5±0.05)g、奶粉(0.5±0.01)g，置50 mL离心管中，加20%乙醇乙腈溶液8 mL，涡旋混匀，中速振荡5 min，5 000 r/min离心10 min。收集上清液于另一50 mL离心管中。残渣重复提取1次。合并两次上清液，加水15 mL和三乙胺50 μL，混匀，备用。

依次用乙腈5 mL、固相萃取柱洗涤液5 mL，活化C18固相萃取柱。将备用液过柱，抽干。加异辛烷3 mL洗涤，抽干。用乙腈5 mL洗脱。收集洗脱液于10 mL试管中，50 ℃下用氮气吹干。备用。

向试管中依次加入衍生化试剂A液100 μL和衍生化试剂B液150 μL，密闭，涡动10 s，依次加冰醋酸、三乙胺各50 μL，涡动10 s，65 ℃避光密闭反应15 min，取出后加650 μL甲醇混匀。经0.45 μm微孔滤膜过滤，供高效液相色谱检测。

1.3.4 检测限及定量限 分别取牛奶、羊奶和奶粉的空白样品进行添加回收试验，按照上述样品前处理方法处理，进HPLC分析。以S/N≥10，且在该添加水平的回收率和变异系数均满足残留分析要求的最小浓度作为定量限(LOQ)，以S/N=3作为药物的检测限(LOD)。

1.3.5 准确度和精密度 采用标准添加法，在牛奶和羊奶中添加3个不同浓度(0.5 μg/kg、10 μg/kg和50 μg/kg)的阿维菌素类标准溶液进行回收率测定，每个浓度设定5个平行样品，同时进行空白试验，重复3次，求每个样品的回收率和批内、批间相对标准偏差(RSD)。按照相同方法，在奶粉中添加3个不同浓度(5 μg/kg、100 μg/kg和500 μg/kg)的阿维菌素类标准溶液，计算每个样品的回收率和批内、批间RSD。

2 结果

2.1 标准曲线及线性范围 4种阿维菌素类药物在0.5～1 000 μg/L浓度范围内呈现良好的线性关系，其曲线方程和相关系数(R)见表1所示。

2.2 检测限及定量限 空白试料按1.3.3步骤处理后，测定结果表明，在相应的保留时间处，不同来源的空白试料对所测分析物均无干扰。图1～3分别是羊奶空白样品、标准对照液及0.5 μg/kg羊奶添加样品的色谱图。

表1 4种阿维菌素类药物的回归方程及相关系数

图1 空白羊奶色谱图 图2 4种阿维菌素类药物标准溶液色谱图 图3 0．5μg/kg羊奶添加样品的色谱图

按照S/N=3计算，4种药物在牛奶和羊奶中的检测限均为0.2 μg/kg，在奶粉中的检测限为 2 μg/kg。在牛奶、羊奶中分别添加4种药物的标准溶液，使其添加浓度分别为0.2、0.5μg/kg和2 μg/kg；在奶粉中添加4种药物的标准溶液，使其添加浓度分别为2、5μg/kg和20 μg/kg。按照1.3.3提取净化方法处理后，经HPLC检测。测定结果显示，牛奶、羊奶中4种药物的添加浓度为0.5 μg/kg时，S/N≥10，且回收率均大于90%，变异系数小于8.7%；奶粉中4种药物的添加浓度为5 μg/kg时，S/N≥10，回收率均大于91%，变异系数小于8.9%。为此，确定该方法中乙酰氨基阿维菌素、阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素在牛奶、羊奶组织中的定量限为0.5 μg/kg；在奶粉中的定量限为 5 μg/kg。

2.3 准确度和精密度 牛奶、羊奶和奶粉中3个浓度阿维菌素类药物添加回收试验的回收率、批内RSD和批间RSD的汇总结果见表2。

表2 4种阿维菌素类药物准确度及精密度试验数据 (n = 5)

由表2数据可知，该方法在牛奶、羊奶和奶粉中的平均回收率为89.2%～113%；批内变异系数为0.45%～9.73%，批间变异系数为2.90%～10.6%。方法准确度、精密度良好。

3 讨论

3.1 提取条件的优化 现有标准GB 29696-2013使用乙腈8 mL分两次提取牛奶中的4种药物，提取过程简单，提取效率高[6]。但针对羊奶和奶粉提取效率则显著降低，羊奶和奶粉中的乙酰氨基阿维菌素回收率分别低于50%和30%，其他3种药物的回收率也有不同程度的降低。

因此，考虑改变提取液极性，以提高羊奶和奶粉中各药物的提取效率。乙醇毒性小，极性较乙腈更低，经试验摸索，在乙腈中加入一定比例的乙醇，确实可以有效提高羊奶和奶粉中的4种药物的提取效率。但乙醇比例过高，会削弱乙腈沉淀蛋白的能力，后续净化步骤困难；乙醇比例过低，又会不同程度的影响羊奶，尤其是奶粉中各药物的提取效率。所以，经进一步摸索，最终确定提取液组成为乙腈∶乙醇=8∶2(v/v)。此提取液对牛奶、羊奶、奶粉3种基质中4种药物的提取效率均可达到80%以上。

3.2 净化条件的优化 对动物组织及奶中阿维菌素类药物的净化有采用C18固相萃取柱、碱性氧化铝柱，也有方法采用两柱联用[4～7]。张启迪等比较了碱性氧化铝柱和C18柱的净化效果，认为碱性氧化铝柱净化效果更好。但其试验样本单一，仅针对鱼肌肉样品；检测药物仅包括阿维菌素和多拉菌素[8]。现有标准GB 29696-2013及程林丽等检测牛奶中的4种阿维菌素类药物，采用了C18柱[6,9]。本方法进一步摸索了C18固相萃取柱的柱效和过柱溶液中有机相和水相的最佳混合比例，最终采用C18固相萃取柱，向提取液中加水15 mL，从而在保证C18固相萃取柱对药物保留效率的同时也缩短了过柱时间。

3.3 衍生化条件的优化 对阿维菌素类药物的衍生化试剂普遍使用N-甲基咪唑-乙腈(1+1，v/v)和三氟乙酸酐-乙腈(1+2，v/v)进行，但不同方法间衍生化反应条件有所差异，反应温度、时间跨度较大，光照要求也不同[4,6,9-10]。经本试验摸索，目前多数方法采用的室温下衍生化反应 15 min 或30 min并不充分，尤其是乙酰氨基阿维菌素，随着反应时间的延长衍生化产物的含量持续升高。

因此，本试验对衍生化反应的温度、时间、光照条件进行了更为深入的摸索。首先，在实验室明亮光照和避光两种条件下取标准溶液常温下反应80 min，结果显示。明亮光照条件下4种药物的峰面积均明显低于避光条件下的药物的峰面积。

然后，对比了避光条件下常温、50 ℃和65 ℃3种温度下0、15、30、45、60、75 min及100 min各反应时长的衍生化效率。测定结果显示，常温反应80 min和65 ℃反应15 min这两种条件下4种阿维菌素药物的衍生产物含量最高，时间延长至100 min，阿维菌素的衍生化产物反而略有减少。

综合考虑4种药物的反应效率以及试验时长，本试验确定衍生化反应条件为65 ℃避光反应15 min。此反应条件下的衍生化反应效率高、反应充分，并且反应后的衍生化产物加入甲醇后形成的醇式衍生化产物含量稳定，反应结束后立即进样与存放数小时、1 d以及1周后再进样所得的检测组分的峰面积没有明显差异。

综上所述，本试验建立了一种适用于牛奶、羊奶和各类奶粉中4种阿维菌素类药物的残留检测方法。用乙腈-乙醇溶液提取样品中的药物，加水稀释后经C18固相萃取柱净化，在65 ℃避光条件下衍生化反应15 min。反应结束后加入甲醇，使衍生化产物形成稳定的醇式衍生化产物，之后用高效液相色谱—荧光检测法分析，外标法定量。该方法操作简单，灵敏度高，准确度和精密度好，可以很好地满足牛奶、羊奶及奶粉中阿维菌素类药物的实际检测需要。

[1] 李俊锁，邱月明，王超. 兽药残留分析[M]. 上海: 上海科学技术出版社, 2O02: 257-262.

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[6] 中华人民共和国GB 29696-2013 牛奶中阿维菌素类药物多残留的测定 高效液相色谱法 [S]. 2013.

[7] 中华人民共和国国家标准 GB/T 22968—2008 牛奶和奶粉中伊维菌素、阿维菌素、多拉菌素和乙酰氨基阿维菌素残留量的测定 液相色谱—串联质谱法 [S].2008.

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Determination of 4 kinds of avermectin residues in milk and milk powder by HPLC

ZHANG Yu-jie , LI Dan , LI Qian , WANG He-jia

(China Institute of Veterinary Drug Control , Beijing 100081,China)

An HPLC method for the determination of Eprinomectin, abamectin, ivermectin and doramectin in milk, goat milk and milk powder was developed. The 4 avermectin residues in the samples were extracted with 20%ethanol-acetonitrile solution and the supernatant of the extract was diluted with water and triethylamine, and then applied onto a C18solid phase extraction column for clean-up. The elution was evaporated to dryness and derivatized by 65℃ under darkness for 15 min . The derivatives were achieved by HPLC, and the detection was performed with a fluorescence detector. The calibration curves showed nearly perfect linearity between the peak areas and concentrations of 4 avermectins in range from 0.5 to 1000 ng/mL. The limit of quantification(LOQ) was 0.5 μg/kg for 4 avermectins in milk and goat milk and 5 μg/kg in milk powder. The average recoveries at a range of concentrations were 89.2%-113%, and intra - and inter - batch variation coefficients were 0.450%-9.73% and 2.90%-10.6% respectively. This simple HPLC method with high sensitivity, accuracy and precision can be applied for the detection of avermectins in milk, goat milk and milk powders.

avermectin; milk; milk powder; HPLC

WANG He-jia

2016-10-14

国家农产品质量安全风险评估项目(GJFP201600702)

张玉洁(1981 -)，女，助理研究员，硕士，从事兽药残留检测方法学研究，E-mail:wenkzyj@163.com

王鹤佳，E-mail:pharhejia@163.com

S859

A

0529-6005(2017)04-0088-04