张桂枝，靳双星，姬向波

(河南牧业经济学院动物科技学院，河南郑州450046)

河南地区三黄鸡ALV感染的血清学调查

张桂枝，靳双星，姬向波

(河南牧业经济学院动物科技学院，河南郑州450046)

采取河南省3个三黄种鸡场种鸡的泄殖腔棉拭子和蛋清样本，利用ELISA检测ALV-p27；检测血清中ALV-J、ALV-A/B两种抗体，同时采集其血液接种DF-1细胞，培养9 d后检测细胞培养液中ALV-p27。结果表明：3个种鸡场泄殖腔棉拭子抗原阳性率分别为12.36%、8.15%和24.28%；蛋清抗原阳性率分别为7.17%、5.09%和14.44%；ALV-A/B抗体阳性率分别为11.96%、6.52%、33.70%；ALV-J抗体阳性率分别为3.26%、2.17%、22.83%；DF-1细胞培养液中ALV-p27阳性率分别为8.57%、6.67%、18.52%。试验结果为下一阶段各鸡场开展净化工作提供了科学依据。

三黄鸡 ； 禽白血病 ； p27抗原 ； 血清抗体

禽白血病病毒 (ALV)是一种主要通过种鸡传播的致肿瘤性病毒。早期A、B亚群ALV是引起鸡群淋巴性白血病和各类型肿瘤的主要亚群，后来又出现致病性更强的J亚群ALV。我国于1999在商品肉鸡中分离检测到ALV-J，由于前几年一直未采取全面的禽白血病净化措施，迄今许多地区蛋鸡、肉鸡以及地方品种鸡群中ALV感染仍较普遍[1-8]。为了解河南地区三黄鸡ALV的感染情况，选取河南省2个不同地区及1个疑似禽白血病感染的种鸡场三黄鸡为研究对象，利用酶联免疫吸收试验(ELISA)检测泄殖腔棉拭子、蛋清ALV-p27抗原；抽取部分鸡的血清检测ALV-J和ALV-A/B两种抗体；同时抽取部分鸡的血液接种DF-1细胞，培养9 d后取细胞上清液检测ALV-p27，以判断鸡群外源性ALV的感染情况，为实施该地区三黄鸡的净化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物 20～25周龄，3个种鸡场1 380只三黄鸡。

1.2 主要仪器设备 二氧化碳培养箱(Thermo公司)；NIKON ECLIPSE TS100型倒置显微镜，HFsafe-1200生物安全柜，酶标仪(Thermo公司)；微量加样器等。

1.3 主要试剂 ALV-p27抗原检测试剂盒，购自BioChek公司；ALV-A/B 和 ALV-J 抗体检测试剂盒，购自IDEXX公司；DMEM培养液，购自GIBCO公司；新生牛血清，购自GIBCO公司,以及胰酶等。

1.4 细胞 DF-1细胞(河南农业大学保存)。

1.5 方法

1.5.1 泄殖腔棉拭子ALV-p27抗原检测 采样前在样品管中加入1 mL样品稀释液，无菌棉签采集试验鸡泄殖腔棉拭子，与稀释液混匀后冷冻。反复冻融2次，检测前将样品恢复至25 ℃，吸取100 μL上清液，加入到ELISA反应板中，按照ELISA试剂盒的操作说明书进行操作。以405 nm的波长于酶标仪测定对照和样品的吸光度，通过计算检测样品与阳性对照比值(S/P)进行样品的阴、阳性判定。

1.5.2 种蛋ALV-p27抗原的检测 收集试验鸡的种蛋，每枚种蛋取1 mL蛋清反复冻融2次后，检测前将样品恢复至25 ℃，吸取100 μL蛋清液,加入到ELISA反应板中，按照ELISA试剂盒的操作说明书进行操作。

1.5.3 血清ALV特异性抗体的检测 采集试验鸡促凝血，4 000 r/min离心10 min分离血清，用稀释液将血清作1∶500稀释，然后用禽白血病抗体检测试剂盒检测ALV-J亚型及ALV-A/B亚型2种抗体，具体检测方法参见试剂盒说明书。

1.5.4 DF-1细胞培养液ALV-p27的检测 无菌采集试验鸡抗凝血，接种于已长成单层的DF-1细胞，37 ℃ 继续孵育2 h，弃上清液，更换为含有1%新生牛血清的DMEM培养液，在37 ℃、5%CO2条件下继续培养9 d。然后冷冻，反复冻融2次后，取细胞培养液用ELISA试剂盒检测ALV-p27抗原。

2 结果与分析

2.1 泄殖腔棉拭子ALV-p27抗原检测结果 ELISA检测泄殖腔棉拭子ALV-p27抗原结果显示，3个种鸡场抗原阳性率均较高，但不同场之间有很大差异，其中疑似ALV感染的C场抗原阳性率最高。A、B、C场泄殖腔棉拭子抗原阳性率分别为12.36%(91/736)、8.15%(30/368)和24.28%(67/276)，检测结果见表1。

表1 泄殖腔棉拭子ALV-p27检测结果统计

2.2 蛋清ALV-p27抗原检测结果 ELISA检测蛋清ALV-p27抗原结果显示，3个种鸡场蛋清样品中都检测出抗原阳性个体，其中疑似ALV感染的C场抗原阳性率最高。A、B、C场蛋清抗原阳性率分别为7.17%(33/460)、5.09%(14/275)和14.44%(26/180)，检测结果见表2。

表2 蛋清ALV-p27检测结果统计

2.3 血清ALV-A/B和ALV-J抗体检测结果 ELISA检测ALV-A/B和ALV-J两种抗体结果显示，3个种鸡场血清样品中都检测出ALV-A/B和ALV-J阳性抗体，其中ALV-A/B抗体阳性率均高于ALV-J阳性抗体率。A、B、C场ALV-A/B抗体阳性率分别为11.96%(11/92)、6.52%(6/92)、33.70%(31/92)；A、B、C场ALV-J抗体阳性率分别为3.26%(3/92)、2.17%(2/92)、22.83%(21/92。检测结果见表3、表4。

表3 血清ALV-A/B抗体检测结果统计

表4 血清ALV-J抗体检测结果统计

2.4 DF-1细胞培养液中ALV-p27抗原检测结果 DF-1细胞培养9 d的上清液用ELISA试剂盒检测ALV-p27抗原结果显示，3个种鸡场血液样品中都检测出抗原阳性个体，A、B、C三个种鸡场抗原阳性率分别为8.57%(3/35)、6.67%(2/30)和18.52%(5/27)，检测结果见表5。

表5 DF-1细胞培养液中ALV-p27抗原检测结果统计

3 结论与讨论

p27抗原是ALV-亚群共有的主要抗原蛋白，因此,在ALV的检测和净化工作中广泛采用ELISA方法检测ALV-p27。本试验采用泄殖腔棉拭子、蛋清及DF-1细胞培养液等多种检测材料检测ALV-p27，提高了抗原检出率。通过研究发现，3个三黄鸡场都不同程度的感染了禽白血病病毒。疑似ALV感染的C场，泄殖腔棉拭子、蛋清及DF-1细胞培养液中ALV-p27抗原阳性率均显著高于A、B场；ALV-A/B和ALV-J抗体阳性率也显著高于A、B鸡场，说明不同的鸡场ALV感染程度有很大差异。另外，从检测结果来看，3个鸡场都同时存在ALV-A/B抗体阳性个体和ALV-J抗体阳性个体，但均是ALV-A/B抗体阳性率高于ALV-J抗体阳性率，说明3个鸡场都存在ALV-A/B和ALV-J 2种或3种外源性病毒同时感染的可能，但A/B亚群的感染率高于J亚群。对检测结果进行分析，发现鸡群中存在无病毒有抗体(V-A+)、有病毒无抗体(V+A-)和有病毒有抗体(V+ A+)个体，说明本地区ALV 感染的非常复杂。血清型 V+A-的母鸡以不同但较高比例向其子代垂直传播；血清型V-A+存在，说明鸡群中存在间歇排毒鸡只。所以在净化过程中需要进行多次检测並进行淘汰。

乔新永等[6]从三黄鸡临床多发性肿瘤病例中分离出J亚群禽白血病病毒，王培坤等[7]从三黄鸡临床血管瘤病例中分离出AJ亚群禽白血病病毒；张胜斌[11]对广西地区三黄鸡禽白血病进行调查，结果表明，广西ALV 感染在三黄鸡品系内普遍存在，有的场ALV-A/B抗体阳性率高于ALV-J，有的场ALV-J抗体阳性率高于ALV-A/B，有的场2种抗体阳性率接近；本调查结果表明，河南3个三黄鸡场ALV-A/B抗体阳性率都高于ALV-J抗体阳性率。以上检查结果说明，我国的三黄鸡有相当比例鸡场存在ALV 感染，但不同鸡场ALV 感染亚型有差异。因此，各地方品种鸡场应根据ALV感染动态、公司规模和发展实力，制定切实可行的净化措施和净化方案，尽量减少ALV感染率，减少对后代的垂直传播，以保护我国优良的地方品种。

[1] 孙淼,李金彩,郭振华,等.J亚型禽白血病病毒的分离与鉴定[J].中国兽医杂志,2009,45(10)：46-48.

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[7] 王培坤,毕玉彧,秦丽莉,等.三黄鸡临床血管瘤病例中分离出A亚群与J亚群禽白血病病毒[J].动物医学进展，2015,36(3):13-16.

[8] 张胜斌,吴天威,吴丹,等.广西三黄鸡禽白血病流行病学的调查[J].广西畜牧兽医，2010，26(1):12-14.

2016-03-16

河南省科技攻关计划项目(142102110044)；校科技创新团队项目(HUAHE2015003)

张桂枝(1970-)，女，副教授，硕士，从事畜禽疫病防治的教学与科研工作，E-mail：zhangguizhi666@126.com

靳双星,E-mail:jinshuangxing@126.com

S831.7

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0529-6005(2017)04-0086-02