乔彩霞，汪 琳，蒲 静，高志强，刘 环，艾 军 ，张 伟，尹 羿

(1. 北京出入境检验检疫局，北京朝阳100026 ； 2. 云南出入境检验检疫局，云南昆明650228)

进境蓝舌病抗体阳性动物带毒分析及检疫处理研究

乔彩霞1，汪 琳1，蒲 静1，高志强1，刘 环1，艾 军2，张 伟1，尹 羿1

(1. 北京出入境检验检疫局，北京朝阳100026 ； 2. 云南出入境检验检疫局，云南昆明650228)

为评估进口蓝舌病病毒(BTV)抗体阳性动物的感染状态，分析其带毒风险，对从国外进口的9批19714头动物，无菌采集全血分离血清，采用竞争ELISA方法检测BTV抗体。对BTV抗体检测阳性的动物，采集抗凝血，采用OIE推荐的套式RT-PCR和荧光RT-PCR方法进行检测，同时将样品送往蓝舌病参考实验室进行病毒分离鉴定，以确定动物的蓝舌病感染状态。结果9批动物中检出28头BTV抗体阳性动物，但核酸检测和病毒分离鉴定的结果均表明这些BTV抗体阳性动物并不携带有非感染性和感染性病毒粒子。结合9个批次的进口动物并无明显临床表现，且进口动物来源地也无蓝舌病(BT)的疫情发生，据此根据OIE《陆生动物卫生法典》条款，判定这些抗体阳性动物为带毒阴性。本研究通过对BTV抗体阳性动物的带毒分析，并结合OIE确定BTV感染的要求，对BTV口岸隔离检疫流程提出建议，以指导动物检疫工作，阻止病原经口岸传入。

蓝舌病 ; 抗体阳性 ; 感染状态 ; 检疫

蓝舌病(Bluetongue，BT)是由蓝舌病病毒(BluetongueVirus，BTV)引起反刍动物的一种非接触性虫媒传播疫病。近年来，BT在全球的流行范围不断扩大，BTV的血清型增多且毒力增强，至今已从非洲、欧洲、亚洲、北美、南美和大洋洲的多个国家分离到BTV[1-3]。随着我国从国外进口种用反刍动物的种类和数量的增加，BT经口岸传入我国的风险加大，这就要求我们对进境动物进行严格的检疫监管以防止疫病传入我国。

目前，我国要求进境动物必需来自BT非疫区，并执行严格的检疫，一经检出阳性带毒动物，全群捕杀。2010-2014年间，北京口岸从进口的9批动物中检出28头BT抗体阳性动物，涉及动物包括奶牛、长颈鹿和羊驼。本研究对这些BT抗体阳性动物的带毒情况进行了研究，并提出相应的检疫处理技术规范，以指导口岸BT的检疫工作，保证了进口动物的健康安全和国际贸易的正常进行。

1 材料与方法

1.1 进口动物样品 2010-2014年，从北京口岸入境的的9个批次共19 714头反刍动物，动物种类包括长颈鹿、奶牛、羊驼等，来源国家包括南非、澳大利亚和荷兰，如表1所示，采集所有入境动物的全血和抗凝血样品用于研究。

表1 2010-2014年间采集的北京口岸进口反刍动物样品信息

1.2 主要试剂 用于检测BTV抗体检测的试剂盒有3种，分别为法国IDVET公司生产的BTV抗体竞争ELISA试剂盒、美国VMRD公司生产的BTV抗体竞争ELISA试剂盒和美国IDEXX公司生产的BTV抗体竞争ELISA试剂盒。酶包括有GoTaqDNA Polymerase、M-MLV Reverse Transcriptase、RNase inhibitor，购自Promega公司；RNA提取试剂盒(RNeasy® Mini Kit)，购自QIAGEN公司；胶回收试剂盒(E.Z.N.A.® Gel Extraction Kit)，购自Progema公司；dNTP购自北京华美生科生物技术有限公司；Trans 5K、Trans 2K DNA Marker，购自北京全式金生物技术有限公司。

1.3 BTV核酸检测用引物/探针 按照OIE《陆生动物卫生手册》中推荐的BTV套式RT-PCR和荧光RT-PCR技术[1]，合成引物和探针，序列见表2，由宝生物工程(大连)有限公司合成。1.4 样品采集和前处理 无菌采集全血，分离血清后用于BTV抗体检测。采集可疑动物的抗凝血(抗凝剂为肝素或EDTA)，用PBS磷酸盐缓冲液(0.01 mol/L，pH值7.2～7.4)洗涤血样3～4次，每次2 000 r/min离心10 min，弃上清液，加入等量PBS，采用TRIZol法提取RNA后用于BTV核酸检测；或加入等量乳糖蛋白胨培养液(BLP，含青霉素2 000 IU/mL、链霉素2 000 μg/mL)，置冰浴中用超声波处理(40μA、1min)，用于BTV病毒分离。

表2 检测用引物、探针的名称、序列及位置

1.5 ELISA检测BTV抗体 采用法国IDVET的BTV竞争ELISA试剂盒对进口的9批动物(未进行BTV免疫)的血清样品进行检测，对检测阳性的样品采用美国IDEXX和VMRD公司的试剂盒重复进行检测，比较检测结果，最终确定抗体阳性动物。

1.6 套式RT-PCR和荧光RT-PCR检测BTV核酸 BT抗体检测阳性的动物，采集抗凝血，经处理后提取RNA，采用OIE推荐的套式RT-PCR和荧光RT-PCR方法进行检测。

套式RT-PCR 分为两步进行，第一步RT-PCR，每个反应的组分：Nuclease-free water 11.8 μL，5× one-step RT-PCR Buffer 5.0 μL，dNTP Mix 1.0 μL，Enzyme1.0 μL，FW primer (25 pmol/mL 0.6 μL，RV primer (25 pmol/μL) 0.6 μL，5 μL RNA，合计25 μL；反应程序：50 ℃ 30 min；95 ℃ 15 min；94 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，35个循环；72 ℃ 10 min。第二步套式PCR，每个反应的组分：Nuclease-free water 40.75 μL，10×HotStar Buffer 5.0 μL，dNTP Mix 1.0 μL，HotStarTaq0.25 μL，nFW primer (25 pmol/μL) 1.0 μL，nRV primer (25 pmol/μL) 1.0 μL，第一阶段扩增的DNA 1.0 μL，合计50 μL；反应程序： 95 ℃ 15 min；94 ℃ 45 s ，62 ℃ 45 s ，72 ℃ 1 min，28个循环；72 ℃ 10 min，反应结束后用1.5%琼脂糖凝胶电泳分析PCR扩增结果。

1.7 病毒分离鉴定 选取BTV抗体阳性动物中抗体滴度较高的10头动物的抗凝血，经处理后进行病毒分离。接种鸡胚：无菌静脉接种10～11日龄发育良好的SPF鸡胚，每份样品接种5个鸡胚，每个鸡胚接种0.1 mL样品，接种后封口，置33.5培养，逐日观察并记录，24 h内死亡的鸡胚为非特异性死亡，将48 h后死亡的鸡胚置于4 ℃冰箱保存，于接种后6 d为死亡的鸡胚一起收毒。收毒时每个胚体取若干组织块(有病变时取病变组织)，置乳钵中研磨后，按1∶5加入BLP(含青霉素2 000 IU/mL、链霉素2 000 μg/mL)，置4℃浸提4 h后当日使用，剩余样品置-70 ℃保存备用。

接种敏感细胞：在12孔细胞培养板上培养蚊子细胞(C6/36)细胞单层，将收获的鸡胚上清液，接种细胞单层，每份病料接种两孔，每孔接种0.1 mL，置25 ℃培养7 d后，收取细胞悬液，接种BHK21细胞单层，37 ℃吸附1 h后，加入维持液置37 ℃培养，逐日观察细胞病变，连续观察7 d。如盲传2代出现细胞病变，采用RT-PCR试验进行鉴定。

2 结果

2.1 ELISA检测BTV抗体 采用法国IDVET的BTV竞争ELISA试剂盒对北京口岸进口的9批未进行BTV免疫的动物进行检测，并对检测阳性的样品采用美国IDEXX和VMRD公司的试剂盒重复进行检测确认，共在9个批次的进口反刍动物中检出28头BTV抗体阳性动物，且每1批次均有抗体阳性动物，抗体阳性率为0.03%～66.7%，来自于南非的长颈鹿抗体阳性率最高，平均高达42%，其次为荷兰的羊驼，阳性率为20%，详细情况见表3。

2.2 套式RT-PCR和荧光RT-PCR检测BTV核酸 将BTV抗体检测阳性的全部18头动物分别采集抗凝血，经处理后提取RNA，分别采用套式RT-PCR和荧光RT-PCR进行检测，结果套式RT-PCR有2份在100 bp附件有扩增条带，经基因克隆后测序，测序结果在GenBank中进行Blast分析，结果扩增条带为非特异性扩增不是BTV的基因序列，荧光RT-PCR检测结果全部为阴性。结果表明，18头抗体阳性动物并不携带有非感染性病毒粒子。

表3 ELISA检测BTV抗体阳性动物结果

2.3 病毒分离鉴定 选取10头BTV抗体滴度较高动物的抗凝血，经处理后进行病毒分离，鸡胚和细胞均未出现病理变化，同时对细胞培养物提取核酸后，经RT-PCR和荧光RT-PCR鉴定为阴性，表明动物均不带有感染性的病毒。

3 讨论

蓝舌病是世界动物卫生组织(OIE)规定的必须通报多种动物共患病，我国农业部也将其列为一类动物传染病。我国现行法律规定，一旦进口动物检出BTV感染，全群动物将作扑杀、销毁或退回处理。OIE动物卫生法典中规定，要确定发生BTV感染，需要满足以下条件[4]：一是从动物或其产品中分离、鉴定出BTV；二是表现有BT临床症状且排除其他疫病的动物，或与确诊或疑似病例有流行病学关联的动物，或是认为与BTV接触过的动物，并在其体内检测BTV抗原或特异性核酸(RNA)；三是上述动物非免疫情况下检出结构蛋白抗体，或免疫情况下检出非结构蛋白抗体。因此，对于检疫中未免疫的BTV抗体阳性动物，需要经过病毒分离鉴定、核酸检测或者流行病学分析，才能确定其BTV感染状态。

BTV抗体阳性动物是否带毒，对其动物个体和同群动物的处置至关重要。为科学评估进口BTV抗体阳性动物的感染状态，分析其带毒风险，本研究采集了BTV抗体阳性动物的抗凝血，进行了病毒核酸检测和病毒分离鉴定。结果，病毒分离鉴定和核酸检测的结果均表明所有BTV抗体阳性动物并不携带有感染性和非感染性病毒粒子，结合9个批次的进口动物并无明显临床表现，且进口动物来源地也无BT的疫情发生，据此根据OIE《陆生动物卫生法典》条款，判定这些抗体阳性动物为带毒阴性。

但研究表明，BTV感染后抗体和病原可能共存在于血液循环系统和免疫器官中，存在带毒风险[5]，为了进一步降低病毒经口岸传入我国的风险，建议延长隔离检疫时间，将BTV抗体和核酸检测阳性样品送参考实验室进行确诊，以增加临床和实验室检出率，确诊动物无感染后方可放行。此外，库蠓是BT传播必不可少的媒介[6]，因此进口动物在隔离检疫期间，除了严格按照流程做好实验室检验，还应采用库蠓防护措施[7]，包括喷撒灭蠓药品或通过雾熏，控制和消灭媒介昆虫，防止媒介昆虫造成的潜在传播风险。

[1] OIE. Terrestrial ManualChapter 2.1.3-Bluetongue [EB/OL].http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.01.02_Bluetongue.pdf.2014.

[2] 何宇乾，吴海燕，徐琼.蓝舌病的流行现状[J]．中国兽医科学，2012，42(5)：537-540.

[3] 苗志强，郑明学，古少鹏，等. 蓝舌病的流行状况及防控措施[J].黑龙江畜牧兽医，2010，5：28-30.

[4] OIE.Terrestrial Code Chapter 8.3- Infection with bluetongue virus. [EB/OL].http://www.oie.int/index.php?id=169&L=0&htmfile=chapitre_bluetongue.htm.

[5] Giovannini A, MacDiarmid S, Calistri P,etal. The use of risk assessment to decide the control strategy for bluetongue in Italian ruminant populations [J]. Risk Analysis, 2004,24:1737-1753.

[6] Brugger K, Rubel F. Bluetongue disease risk assessment based on observed and projected Culicoides obsoletus spp. vector densities [J]. PLoS ONE, 2013, 8： e60330.

[7] Maclachlan N J, Mayo C E. Potential strategies for control of bluetongue, a globally emerging, Culicoides-transmitted viral disease of ruminant livestock and wildlife [J]. Antiviral Res， 2013,99(2):79-90.

Virus carrier analysis andentry-exit quarantine of bluetongue virus seropositive animals in international trade

QIAO Cai-xia1, WANG Lin1, PU Jing1, GAO Zhi-qiang1, LIU Huan1, AI Jun2, ZHANG Wei1, YIN Yi1

(1.Beijing Enrty-exit Inspection and Quarantine Bureau , Beijing 100026 ，China； 2.Yunnan Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau , Kunming 650228,China)

The objective of the present study was to investigate the infection status and virus carrier state of bluetongue virus (BTV) seropositive animals. In this study, 19714 sera were aseptically collected from 9 batches of imported animals and tested for anti-BTV antibodies by competitive ELISA. For the seropositive animals, the presence of BTV was detected using real-time RT-PCR or RT-nPCR from anticoagulant-treated whole blood according to the recommendation of OIE. Meanwhile, to confirm the infection status, all positive samples were sent to the BT reference laboratory at Yun Nan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau and subjected to virus isolation. Among the19714 animals that were tested, 28 were positive for antibodies against BTV. However, infectious or noninfectious virus could not be detected by virus isolation (VI) technique or nucleic acid tests. Furthermore, there were no significant clinical symptoms present in the 9 batches of imported animals, and the origin place had no BT epidemic. Based on the above results and relevant items in the OIE“Terrestrial Animal Health Code”, the conclusion was drown that there was no virus presence in seropositive animals.Also, the quarantine procedure for BTV was proposed in this study according to the detection of virus from BTV seropositive animal and the requirement for definite diagnosis of BT by OIE, which will be useful for specific guidelines for trading animals quarantine and preventing potential invasion of BTV.

bluetongue； seropositive ； infection status ； quarantine

2016-01-22

国家质检总局科技计划项目(2014IK249)

乔彩霞(1978-)，女，高级兽医师，博士，主要从事动物疫病检测技术研究 ，E-mail:qiaocx@bjciq.gov.cn

S852.65+9

A

0529-6005(2017)04-0079-03