朱 军， 钟 承， 王安琦， 罗旭阳， 陆宝生， 吕艳丽， 李文鹏

(1.中国农业大学动物医学院，北京海淀100193 ； 2.北京中农大动物医院有限公司，北京海淀100193 ；3.北京出入境检验检疫局， 北京朝阳100026 ； 4.河南省社旗县动物疾病预防控制中心，河南社旗473300)

细小病毒抗原快速检测卡临床使用效果评价

朱 军1，2， 钟 承1，3， 王安琦1， 罗旭阳1， 陆宝生1， 吕艳丽1， 李文鹏4

(1.中国农业大学动物医学院，北京海淀100193 ； 2.北京中农大动物医院有限公司，北京海淀100193 ；3.北京出入境检验检疫局， 北京朝阳100026 ； 4.河南省社旗县动物疾病预防控制中心，河南社旗473300)

本试验以PCR方法为标准，以临床收集的213份粪便样本为检测对象，对3家商品化犬细小病毒抗原快速检测卡的临床应用效果进行了评价：与PCR方法相比较，3家产品各自的敏感性分别为71.7%，66.4%和72.2%；相对应的特异性分别为96%，97%和96%。3家检测卡彼此之间的符合率分别为96.7%、99.5%和95.8%。以PCR方法和其中两种检测卡对同一窝5只感染犬细小病毒的幼犬的临床病征与CPV检测结果进行相关性评估，结果显示，犬细小病毒抗原快速检测卡的阴性检测结果与病犬临床症状的缓解或消失时间呈正相关，而PCR方法在动物临床病征消失后仍可检出病毒。

犬细小病毒； 抗原快速检测卡； PCR

犬细小病毒(CPV)感染是以呕吐和腹泻并伴有胃肠道出血等为主要病征的急性传染性胃肠道疾病，少数病犬可发生非化脓性心肌炎，各年龄段犬均可发病，以6月龄以下幼犬发病和死亡较多(耿志贤等，2009)。该病传染性强，有些病犬康复后仍可长期通过粪便排毒，成为本病的重要隐性传染源(孔庆波，2008)。病毒对外界因素抵抗力较强，在粪便和固体污染物上病毒可存活数月至数年(陈莉娴等，2014)。近10年来，犬细小病毒抗原快速检测卡(CPV检测卡)因操作快速、简便被广泛应用于国内兽医临床上，对犬细小病毒病的诊疗做出了巨大贡献。尽管目前国内市场上同类产品较多，但尚未见对这些产品的临床实际应用效果进行横向比较研究的相关资料。本实验室以PCR方法为参考标准，对北京世纪元亨动物防疫技术有限公司生产的CPV检测卡进行了临床应用效果评价，与此同时，将其与国内临床上应用广泛的2家同类进口产品的敏感性和特异性进行了比较，以期为宠物医师选择使用检测产品提供科学的数据支持。

1 材料与方法

1.1 犬细小病毒抗原快速检测卡与PCR相关试剂 3种犬细小病毒抗原快速检测卡，分别由北京世纪元亨动物防疫技术有限公司提供(元亨)或从北京代理商处购入的进口犬细小病毒抗原快速检测卡(A和B)。PCRTaqMix由北京艾德莱生物科技有限公司购入。

1.2 粪便样本的采集与预处理 收集到中国农业大学就诊犬的粪便样本612份，每份样本取部分以无菌生理盐水10倍稀释后，加入等量的三氯甲烷，充分混匀后3 000 r/min离心5 min，取上清液，同未经上述处理的粪便样本一起置于4 ℃保存备用。

1.3 粪便样本PCR检测 采用宋永奇等(2008)建立的PCR方法对粪便样本进行PCR扩增。上游引物P1-UP：5′-CCACCTCATATTTTCATCAA-3′，下游引物P1-DOWN：5′-TGAATCCAATCTCCTTCTG-3′，引物分别位于基因组的2 709～2 728位和其互补链的4 015～4 033位，扩增片段长度为1 325 bp。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

煮沸—冰浴法提取病毒DNA(邵伟娟等，2006)：取100 μL“1.2”中已预处理的粪便上清样本放入1.5 mL的离心管中，沸水煮沸10 min，即刻冰浴10 min，12 000 r/min离心15 min，取上清液，作为DNA模板备用。

PCR反应体系：2 X PCR TaqMix 12.5μL，上游引物、下游引物各1μL(0.01 mol/L)，DNA模板 1.0 μL，无菌双蒸水9.5 μL，总体积为25.0 μL。反应条件为：95 ℃预变性4 min后，94 ℃变性30 s，52 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸2 min，35个循环，最后再以72 ℃延伸10 min。反应结束后，取PCR产物 5 μL 经1%琼脂糖凝胶电泳后，紫外成像观察并记录结果。

1.4 粪便样本的CPV抗原快速检测卡检测 将“1.3”中检测结果为阳性的全部样本和结果为阴性但被检样本来自于具有不同程度的腹泻症状，粪便带血/酱油色或含有黏膜脱落组织的病犬粪便样本，分别按(元亨)、A和B 3家公司生产的CPV检测卡说明书所述进行操作，即用抗原检测卡自带的稀释液对粪便样本进行稀释，取适量稀释液加入到CPV抗原快速检测检测卡加样槽内，在规定时间内进行结果判定。

1.5 粪便样本复检 对煮沸-冰浴法PCR检测结果为阴性(或阳性)而任一检测卡检测结果为阳性(或阴性)的样本，采用Tris饱和酚法提取DNA，并以此DNA为模板进行PCR扩增的结果作为样本的最终结果；同时，将这些检测样本离心后取上清液，分别用3种CPV快速检测卡复检，以确定检测卡的最终结果。

1.6 临床病犬康复情况与病原检测结果的相关性观察 在中国农业大学动物医院住院治疗的5只自然感染细小病毒的同窝金毛幼犬，表现为不同程度的厌食、精神不振和腹泻，其中1只有便血症状。其中3只病犬在住院后第4天腹泻症状消失，另外两只第5天腹泻症状消失，并于住院第6天全部出院。对其进行跟踪病原检测，即每日采集病犬粪便，分别以(元亨)和A检测卡及PCR方法进行病原检测，同时记录每日临床症状，并对病原检测结果与病犬的临床病征的改善情况进行了相关性观察分析。

2 试验结果

2.1 PCR检测 以煮沸—冰浴法提取的DNA为模板进行PCR扩增(图1)，对612份粪便样本的CPV带毒情况进行了初筛。选取其中PCR结果为阳性的全部样本和PCR结果为阴性但被检犬具有不同程度腹泻症状、粪便带血或酱油色、粪便中存在黏膜脱落组织的粪便样本，共计213例，用(元亨)和A及B 3家公司生产的CPV快速检测卡进行了检测检验。对检测卡检测为阳性而煮沸冰浴法提取DNA进行的PCR检测结果为阴性的17份样本，经Tris饱和酚法提取DNA后再次PCR扩增。最终共获得113份阳性样本和100份阴性样本。

图1 部分样品凝胶电泳结果

M：DNA Marker DL-2 000；N：阴性对照；3、4、5、8、9、10、12、13、14、15、16号CPV阳性；1、2、6、7、11、17、18号CPV阴性

2.2 CPV抗原快速检测卡检测 经PCR检测为阳性的113例样本和阴性的100例样本，以(元亨)和A及B 3家公司生产的CPV抗原检测卡的检测结果如表1：在113例PCR为阳性的样本中，(元亨)检测卡检出阳性样本81例，阴性32例；A检测卡检出阳性样本75例，阴性38例；B检测卡检出阳性样本82例，阴性31例。对100例PCR检测为阴性的样本，(元亨)检测卡检出阴性样本96例，阳性4例；A检测卡检出阴性样本97例，阳性3例；B检测卡检出阴性样本96例，阳性4例。与PCR检测结果相比较，(元亨)和A及B检测卡的敏感性分别为71.7%、66.4%和72.6%，特异性分别为96%、97%和96%，总符合率分别为83.1%、80.8%和83.6%。(元亨)检测卡和A及B检测卡的符合率分别为96.7%和99.5%，A和B检测卡的符合率为95.8%(见表2)。

表1 CPV抗原快速检测卡检测结果与PCR检测结果的相关性统计

表2 3种检测卡的总符合率

2.3 病犬康复情况与病原检测结果的相关性 对5只住院病犬住院期间每日观察临床症状并对粪便样本进行病原检测：首日5只病犬抗原快速检测卡和PCR方法检测结果均为阳性，均表现为厌食、精神不振，且均有呕吐和腹泻症状，其中3号病犬有便血症状。随着治疗的进行，5只病犬在住院的第3～4天临床症状均明显减轻，其中1、2、5号病犬在第3天不再发生呕吐，第4天腹泻症状消失；3号病犬便血持续至第4天，第5天3、4号病犬腹泻症状消失。住院第6天5只犬均不表现临床症状，全部出院。5只病犬在住院第2～6天的病原检测结果见表3。由表可见，抗原快速检测卡检测结果的变化与患犬体况改善情况较为一致，而PCR方法敏感性高，在动物明显好转乃至临床康复后仍可检测到病毒DNA。

表3 临床病例病原检测结果

3 讨论

3.1 本研究以PCR 方法为标准评估了3个商品化CPV抗原检测卡的敏感性和特异性，为了简便和经济的获取充足的阳性样本，本试验首先以煮沸-冰浴法提取DNA进行PCR扩增；鉴于冰浴煮沸法提取DNA敏感性较低的缺点，本研究以经典的饱和酚法提取DNA为模版进行PCR扩增作为保证PCR方法敏感性的措施，以此结果作为标准依据对检测卡进行敏感性和特异性检验，从而保证了试验方法科学合理。本次试验结果表明，3家公司的CPV抗原快速检测卡的敏感性和特异性无显著差异。尽管与PCR方法相比较，抗原检测检测卡的敏感性均较低，但其快速、简便和经济的优势是PCR方法无法替代的。

3.2 对5例经治疗逐渐康复的临床病例的跟踪检测结果表明，抗原快速检测卡的阳性检出结果与病犬临床症状的严重程度密切相关。当抗原检测卡检测结果转阴性时，临床症状减轻或消失，但此时PCR检测结果仍可为阳性。因此，在临床应用上，快速检测卡的检测结果与动物体征的动态变化更加符合，更有利于评估动物的患病状态，但PCR检测对于动物是否排毒更为敏感。这一结果为宠物医生对临床上犬细小病毒病的经验性预后判断提供了理论依据，同时提示，CPV抗原快速检测卡在今后很长时期内仍将是宠物医院中CPV感染最方便快捷的检测工具，而PCR方法将可能作为抗原快速检测卡的有效补充工具在宠物临床上应用。

3.3 宋永奇等(2008)提到，粪便的复杂成分(食物残渣、细胞碎片、菌体成分等)和检测卡中免疫胶体金复合物或检测线上的抗体发生非特异性结合，可能是造成CPV检测假阳性结果的重要原因，离心粗提可降低假阳性发生率。本试验操作过程中均严格按照CPV快速检测检测卡说明书进行操作，粪便检测前先静置一段时间，而后取其上清，再用快速检测卡自带的稀释液进行稀释和检测。该方法的检验结果与离心上清复检的结果完全一致。这一方面说明，利用CPV抗原快速检测卡进行检验时，将粪便充分静置后取上清进行检测即可有效减少假阳性的发生。

[1] 孔庆波.犬细小病毒病免疫预防研究进展[J].动物医学进展，2008，29(9):62-66.

[2] 陈莉娴，李信朝.犬细小病毒病的诊断和防控[J].畜牧与饲料科学，2014，35(5):114-115.

[3] 宋永奇，李玉燕，吕艳丽，等.种犬细小病毒感染诊断方法比较[J].畜牧与兽医，2008，40(6):31-35.

[4] 邵伟娟，谢建云,胡建华，等.犬细小病毒核酸诊断方法的建立和应用[J].中国比较医学杂志，2006，16(1):9-11.

[5] 耿志贤，时彦胜，郑亚平，等.犬细小病毒病的流行现状调查[J].中国畜牧兽医，2009，36(11):135-137.

2016-02-24

朱军(1990- )，男，硕士，研究方向为动物病毒学，E-mail:asaszhujun@163.com

吕艳丽,E-mail：luyanli@cau.edu.cn

S858.292

B

0529-6005(2017)04-0071-03