高 铎，孔令聪，高云航，王 梓，贾博岩，刘树明，辛九庆，马红霞

(1.吉林农业大学动物科学技术学院， 吉林长春130118； 2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所， 黑龙江哈尔滨150001)

一例牛支原体与多杀性巴氏杆菌混合感染的诊断与治疗

高 铎1，孔令聪1，高云航1，王 梓1，贾博岩1，刘树明1，辛九庆2，马红霞1

(1.吉林农业大学动物科学技术学院， 吉林长春130118； 2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所， 黑龙江哈尔滨150001)

某肉牛养殖场经长途运输的犊牛暴发肺炎，并发生大规模死亡。经主诉和临床症状的分析、肺脏病变观察、病原的形态学检查、分子生物学鉴定，结果确诊为牛支原体(M.bovis)与荚膜血清多杀性巴氏杆菌(A型P.mutocida)混合感染。根据药敏试验结果推荐该场使用恩诺沙星肌肉注射辅以电解多维对患病牛进行治疗，疫情得到有效控制。

牛呼吸系统疾病 ； 牛支原体 ； 多杀性巴氏杆菌 ； 混合感染 ； 抗菌药物敏感性试验

经长途运输的肉牛易患牛呼吸系统疾病(Bovine respiratory disease，BRD)，其不但造成一定死亡率，还能影响肉牛育肥，已成为危害肉牛产业最为严重的疾病之一。近年来发现，牛支原体(Mycoplasmabovis,M.bovis)单独致病或与多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamutocida,Pm)等细菌混合感染协同致病成为引发BRD的重要致病原因之一[1-3]。2013年8月末，通辽市某肉牛养殖场经长途运输的犊牛暴发肺炎，并发生大规模死亡。该场送检样品为发生肺炎的犊牛肺脏和含有患牛浆液性鼻涕的鼻拭子，通过对主诉和临床症状与肺脏病变的分析，以及实验室检验确诊该场暴发的是M.bovis与荚膜血清A型P.mutocida混合感染造成的BRD。通过病原体的抗菌药物敏感性试验(Antibiotic Susceptibility Testing，AST)结果，推荐该场使用恩诺沙星肌肉注射辅以电解多维对患病牛进行治疗，疫情得以控制，未见新发病例。报告如下。

1 材料与方法

1.1 病料来源 采自通辽市某肉牛养殖场患呼吸系统疾病犊牛的鼻拭子。

1.2 主要试剂Taq酶等，均购自TakaRa公司；PPLO肉汤培养基、脑心浸汤(BHI)培养基，均购自青岛海博生物技术有限责任公司；红霉素等8种抗生素标准品，均购自中国食品药品检定研究院。叠氮钠、丙酮酸钠、细菌基因组DNA快速抽提试剂盒，均购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.3 病原分离鉴定 将病牛鼻拭子样本分别接种于改良的PPLO液体培养基(含青霉素与叠氮钠)中和BHI培养基中，培养方法参考文献[1、2]。

1.4 分子生物学鉴定 使用细菌基因组DNA抽提试剂盒提取M.bovis和牛源P.mutocida基因组。

1.4.1 牛支原体特异性鉴定及16S rRNA序列分析 参考Rifatbegovic等合成M.bovisoppD/F基因特异性引物对疑似菌株进行PCR鉴定，预计扩增出1 912 bp的目的条带。参考辛九庆等合成扩增16S-rRNA全长引物，预计扩增出约1.5 kb的目的条带[4]。PCR产物测序后与GenBank中登录菌株的16S rRNA序列比对分析。

1.4.2 牛源多杀性巴氏杆菌特异性鉴定、基因分型 参考Townsend合成P.mutocida种特异性基因引物Kmt1，A、B、D荚膜血清型特异性基因引物capA、capB、capD，使用多重PCR对疑似菌株进行鉴定，预计扩增出460 bp和1 020 bp的特异性条带[2]。自行设计P.mutocida16S rRNA全长引物，预计扩增出约1.5 kb的目的条带，引物序列为：Forward：5′-TCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCTTAAC-3′;Reverse：5′-CACCCCAGTCATGAATCATACCGTGGTAA-3′.各PCR产物测序后与GenBank中登录菌株比对分析。

1.5 菌落计数 用常规方法对P.mutocida进行菌落计数，用倍比稀释法测定M.bovis的颜色变化单位(Colour change unit,CCU)[5]。动物回归试验选取107CFU/mLP.mutocida菌悬液作为接种菌液[2]。P.mutocida和M.bovisAST菌液最佳浓度分别为5×104～5×105CFU/mL和103～104CFU/0.2mL[5-6]。

1.6 动物回归试验 取SPF级BALB/c健康小鼠4只，第1～3只胸腔注射菌量为107CFU/mL的3株P.mutocida菌悬液200 μL，第4只胸腔注射无菌生理盐水作为对照，逐日观察小鼠发病及死亡情况。

1.7 抗菌药物敏感性试验 根据美国临床和实验室标准协会(CLSI)的指导方针[6]，参考《支原体学》[5]，将各抗生素溶解并稀释成2 048 μg/mL的抗生素贮存液。采用改良的微量稀释法AST测定M.bovis对抗菌药物的体外敏感性；采用琼脂稀释法AST测定P.mutocida对抗菌药物的体外敏感性。P.mutocida和M.bovisAST的敏感、中度敏感、耐药标准主要参考CLSI[6]，即氟喹诺酮类：MIC≤0.25定义为敏感，MIC=0.5-1定义为中度敏感，MIC≥2定义为耐药；大环内酯类：MIC≤16定义为敏感，MIC=32定义为中度敏感，MIC≥64定义为耐药；四环素类和氟苯尼考：MIC≤2定义为敏感，MIC=4定义为中度敏感，MIC≥8定义为耐药。质控菌株为金黄色葡萄球菌ATCCR29213和大肠埃希菌ATCC®25922，其MIC值均在CLSI允许的范围内。

2 结果

2.1 临床症状及病理剖检结果 主诉：病牛精神沉郁、咳嗽、气喘、伴有浆液性鼻涕、体温升高、严重者呼吸困难并且进食停止；有的患牛伴有拉稀或继发关节炎。发生肺炎的肺脏质地变硬，肺脏表面广泛分布黄白色干酪样坏死灶(如中插彩版图1)。

2.2 病原的形态学检查结果 采集的3头病牛鼻拭子中各分离得到3株疑似M.bovis与3株疑似P.mutocida。疑似M.bovis菌株在低倍显微镜下的菌落均呈典型的“油煎蛋”样(如中插彩版图2)。疑似牛源P.mutocida在BHI培养基中菌落为圆形、光滑呈露滴状。取典型菌落涂片，染色镜检，均为革兰阴性小杆菌，美蓝染色呈明显的两极着色。

2.3 分子生物学鉴定结果

2.3.1 牛支原体的分子生物学鉴定 利用M.bovisoppD/F基因特异性引物扩增出1 912 bp的片段，与预期片段大小相符。证明所分离的3株疑似菌株均为M.bovis。结果如图3所示。利用16S rRNA全长引物扩增出约1.5 kb的片段，与预期片段大小相符(图略)，该基因片段测序后使用BLAST对其碱基序列进行分析，结果显示，所分离菌株的16S rRNA相应序列与模式株PG45和国内临床分离株HB0801与Hubei-1相应序列同源性均为99%，与无乳支原体PG2相应序列同源性为98%。

图3 M.bovis的oppD/F基因的扩增结果M:DL-2 000; 1-3：P9,P10,P11oppD/F基因PCR产物; 4：阳性对照

图4 P.mutocida的kmt1+capA基因的扩增结果M:DL-2 000;1-3:TL-1,TL-2,TL-3kmt1+capA基因PCR产物4:阳性对照

2.3.2 牛源多杀性巴氏杆菌的分子生物学鉴定与基因分型P.mutocida经多重PCR均扩增得到460 bp和1 000 bp的特异性条带，符合kmt1+capA基因扩增结果，测序后运用BLAST对碱基序列进行分析，其比对结果与GenBank中P.mutocida36950株同源性均高达99%，个别菌株之间有无意义点突变，证明所分离菌株均为牛源荚膜血清A型P.mutocida。结果如图4所示。通过自行设计的16S rRNA全长引物扩增出约1.5 kb的片段，与预期片段大小相符(图略)，测序后使用BLAST对其碱基序列进行分析，结果显示，所分离菌株的16S rRNA与GenBank中P.mutocida36950株同源性均高达99%。

2.4 动物回归试验结果 注射107CFU/mL 3株P.mutocida菌液的小鼠均具有精神不振、食欲下降的症状，并在12 h内死亡，剖检各组死亡小鼠，肺脏触片，碱性美蓝染色，可见两极着色的菌体。对照小鼠24 h内全部正常且剖检后无病理变化。

2.5 抗菌药物敏感性试验结果 微量稀释法测定3株M.bovis的MIC显示，P11对红霉素耐药(MIC≥64 μg/mL)，3株M.bovis均对阿奇霉素和吉他霉素敏感(MIC≤16 μg/mL)，对强力霉素敏感(MIC≤2 μg/mL)，对恩诺沙星敏感(MIC≤0.5 μg/mL)，P9对氟苯尼考耐药(MIC≥8 μg/mL)，P10对氟苯尼考敏感(MIC≤2 μg/mL)；琼脂稀释法测定3株P.mutocida的MIC显示，P.mutocida8除对泰乐菌素中度敏感(MIC=32 μg/mL)外，对其他各抗生素均敏感，其余两株P.mutocida亦对各抗生素敏感。见表2。

表2 8种临床常用抗生素对分离菌的药敏试验结果 (μg/mL)

2.6 治疗 通过对AST结果进行比较，推荐该场使用对两种病原均有较好抑菌作用的恩诺沙星作为治疗首选药物，1次/天，同时辅以电解多维，用于补充机体所需的营养成分，使病牛得以更快康复。据悉，该场按本实验室推荐方案进行治疗后，疫情得以有效的控制。用药后，未新增死亡病例，一周之内患牛大部分痊愈，未见新发病例，极大的减少了该场的经济损失。

3 讨论

本试验通过主诉、临床症状的分析、肺脏病变观察、病原的形态学检查、分子生物学鉴定等方法，确认同时从病牛鼻拭子中分离出的两种微生物分别为M.bovis与荚膜血清A型P.mutocida，从而确诊该场暴发的是M.bovis与荚膜血清A型P.mutocida混合感染造成的牛呼吸系统疾病。M.bovis的感染通常伴随着其他致病菌尤其是P.mutocida的混合感染，且致病菌的混合感染往往可以比单独感染给患牛带来更高的发病率和死亡率，Soehnlen M K.等对美国宾夕法尼亚州采集的90份样品进行BRD主要病原的检测，结果显示，M.bovis、P.mutocida和溶血性曼氏杆菌单独感染检出率分别为41%、1.1%和1.1%，而M.bovis和P.mutocida混合感染检出率为7.8%，M.bovis和溶血性曼氏杆菌混合感染检出率为4.4%[7]；在国内近几年BRD混合感染病例中，主要也为荚膜血清A型P.mutocida和M.bovis混合感染[2-3]。目前普遍认为，长途运输等环境因素刺激是暴发BRD的重要原因之一。所以，今后合理进行“异地育肥”，在运输途中通过保健药物或其他手段缓解应激可能是减少该病发病率的途径之一。

该场依据本试验结果给出的指导建议，成功控制了由M.bovis与荚膜血清A型P.mutocida混合感染引发的BRD，对今后治疗和控制该疾病的暴发起到一定的指导作用，提供了理论依据。如何快速的针对引发BRD的病原及时提出合理的治疗方案将是今后研究的热点方向之一。

[1] 高铎,孔令聪,王梓,等.牛支原体的分离鉴定及其对体外药物的敏感性分析[J].中国兽药杂志,2014,48(3):66-68.

[2] 孔令聪,高铎,高云航,等.吉林省育肥牛呼吸系统疾病的分离鉴定及耐药性检测[J].中国兽医杂志,2014,50(1):34-37.

[3] 肖淦文,彭清洁,崔朋,等.肉牛牛支原体肺炎感染的细菌学研究[J].中国牛业科学,2012,38(3):22-26.

[4] 辛九庆,李媛,郭丹,等.国内首次从患肺炎的犊牛肺脏中分离到牛支原体[J].中国预防兽医学报,2008,30(9):661-664.

[5] 吴移谋,叶元康.支原体学[M].北京：人民卫生出版社,2008：16-25.

[6] CLSI.Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated From Animals;Approved Standard-Fourth Edition〔S〕.CLSI document VET01-A4.Wayne,PA:Clinical and Laboratory Standards Institute，2013.

[7] Soehnlen M K,Aydin A,Murthy K S,etal.Epidemiology ofMycoplasmabovisin Pennsylvania veal calves[J].Journal of dairy science,2012,95(1):247-254.

2014-08-04

国家自然科学基金项目(31272611)；教育部新世纪优秀人才项目(NCET-10-0174)；吉林省世行贷款农产品质量安全项目(2011-Y05)；吉林省牧业管理局项目(20120113)

高铎(1989- )，男，硕士生，从事动物药理与毒理学研究，E-mail：goddard518@126.com

马红霞，E-mail：hongxia0731001@163.com

S852.65+3

B

0529-6005(2017)04-0049-03