刘 兰，梁雄燕,2，李拓凡，顾玉芳，杨玉莹

(1.长江大学动物科学学院，湖北荆州434025 ； 2.长江大学农学院，湖北荆州434025)

散养土鸡J亚群禽白血病病毒和网状内皮组织增生症病毒混合感染的诊断

刘 兰1，梁雄燕1,2，李拓凡1，顾玉芳1，杨玉莹1

(1.长江大学动物科学学院，湖北荆州434025 ； 2.长江大学农学院，湖北荆州434025)

湖北某农户散养的土鸡，鸡群精神委靡、整体消瘦，对病鸡进行剖检，发现部分鸡体表和脏器可见大小不等的肿瘤结节。取病变典型的组织制作病理切片，镜检可看到髓样细胞瘤和网状细胞。提取病鸡组织DNA，用两组Multi-PCR分别检测A、B、J亚群禽白血病病毒(ALV-A、ALV-B、ALV-J)和马立克病病毒(MDV)、禽网状内皮增生症病毒(REV)。结果仅扩增出与ALV-J和REV相应的条带，表明该鸡群为ALV-J和REV混合感染。

J亚群白血病 ； 网状内皮组织增生症 ； 混合感染 ； 病理组织切片 ； Multi-PCR

禽白血病(AL)、马立克病(MD)和网状内皮增生症(RE)是目前对养禽业危害最大的三大肿瘤性疾病，分别由致瘤性病毒ALV、MDV和REV引起。它们不仅能引发肿瘤，还可引起鸡群严重的免疫抑制，极易继发感染其他疾病，导致鸡群死亡率增高，造成不可挽回的巨大经济损失。现在的研究证实，AL、MD和RE在我国禽类养殖中均有存在，且ALV、MDV和REV能混合感染鸡群[1-2]，表现出协同致病作用。ALV、MDV和REV混合感染引起的肿瘤眼观上难以区分，在临床上极易混淆，使用常规的病理组织学方法难以进行鉴别，病毒的分离和鉴定方法所需时间太长，而应用PCR技术能够进行快速诊断。ALV-J和REV的混合感染在肉鸡和蛋鸡中都曾有过报道，但地方鸡种ALV-J和REV的混合感染却少见报道。2015年11月，湖北某养殖户散养的土鸡，鸡群精神委靡、整体消瘦，10周龄始陆续死亡。通过观察临床症状，进而选取症状典型的病鸡进行病理剖检，部分鸡体表和脏器可见大小不等的肿瘤结节。通过Multi-PCR检测，确诊为ALV-J和REV混合感染。

1 材料与方法

1.1 试验材料及处理 湖北某养殖户送检的散养土鸡，剖检后取病变典型的组织，一份用甲醛固定，用于制备病理组织切片，另一份存于-80 ℃冰箱，用作PCR检测。

1.2 主要试剂rTaq、dNTPs等PCR相关试剂以及DL-2 000 DNA Marker等为宝生物工程(大连)有限公司产品。DNA提取相关试剂，由本实验室配制。

1.3 临床诊断与病理学观察 眼观鸡群临床症状，对临床症状典型的鸡群进行病理学剖检，查看各组织脏器的病理变化情况，按照常规方法取材后固定，以备组织切片的制作。

1.4 组织DNA的提取 取症状典型的病鸡的脾、肺、肝、肾，按文献提取DNA[3]。

1.5 引物设计 Multi-PCR引物参照相关文献[4-5]设计，由武汉擎科创新生物有限公司合成，引物序列见表1。

1.6 Multi-PCR检测 PCR反应体系均采用25 μL体系：10×PCR Buffer 2.5 μL，Mg2+(25 mmol/L)1.5 μL，dNTP(2.5 mmol/L each)2 μL，模板DNA 1 μL， rTaq(5 U/μL)0.25 μL，10 pmol/L的引物(ALV-A/B/JF 2 μL，ALV-AR 1 μL，ALV-BR 1 μL，ALV-JR 1 μL)或(REV-F 1 μL，REV-R 1 μL，MDV-F 1 μL，MDV-R 1 μL)，最后用灭菌ddH2O补足至25 μL。

PCR反应条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，58 ℃(ALV-A/B/J)退火30 s或55 ℃(REV/MDV)退火30 s，72 ℃延伸1 min，共进行30个循环；72 ℃终末延伸10 min，4 ℃10 min。

2 结果与分析

2.1 临床症状与病理变化 病鸡多消瘦、精神委靡、鸡冠苍白、生长迟缓、羽毛松乱、个别鸡眼睑粘连(见中插彩版图1A);剖检病鸡腺胃肿大，腺胃乳头出血(见中插彩版图1B);病鸡心脏肿大，切开有白色结节，小肠亦有灰白色肿瘤结节； 肝脏肿大暗红，表面有白色结节(见中插彩版图1C)；将病鸡跗关节周围的皮剥离后发现有肿瘤样赘生物(见中插彩版图1D)。跗关节切片H.E.染色镜检，可见瘤细胞形态基本一致，排列紧密，瘤细胞体积较大，核较大，细胞空泡化、色淡，胞浆内充满嗜酸性红染颗粒[见中插彩版图1E(a为髓细胞)]；脾脏失去原有组织结构，脾脏内能看到网状细胞和大量形态不一的淋巴细胞增生[见中插彩版图F(a为网状细胞，b为大淋巴细胞，c为中淋巴细胞，d为小淋巴细胞)]。

表1 用于检测ALV-A、ALV-B 、ALV-J和MDV、REV的两组Multi-PCR引物

2.2 Multi-PCR结果 以病鸡组织DNA为模板，用Multi-PCR方法分别检测ALV-A、ALV-B、ALV-J和MDV、REV，结果从病鸡组织DNA中扩增出了与ALV-J大小相近的阳性条带和与REV大小相近的阳性条带，而未扩增出与ALV-A/B、MDV相对应的条带(图2)，经测序表明二者分别是ALV-J 和REV的核酸序列。结果表明，病鸡为ALV-J和REV混合感染。

3 讨论

ALV-J和REV是能引起家禽不同组织脏器发生肿瘤和造成宿主免疫抑制的两种反转录病毒，他们对我国的养禽业造成了巨大经济损失[6]。本试验对湖北某农户送检的土鸡进行剖检，病鸡肝脏表面有明显肿瘤结节，小肠有大小不等的灰白色结节，跗关节有肿瘤增生。而ALV-J、ALV-A、ALV-B以及MDV、REV这几种病毒均能诱发肿瘤，但是在外观上不易区分。病鸡心肌肥大增厚，腺胃肿大出血，符合网状内皮增生症和马立克病的病理特征，但病鸡腔上囊萎缩，卵巢无明显病理变化，因此仅靠眼观难以准确判定，确诊还须通过PCR等方法。跗关节肿瘤的病理切片中可见到大量髓样瘤细胞，是ALV-J感染的病理特征，但脾脏组织内能看到网状细胞和大量形态不一的淋巴细胞增生。为弄清是否存在其他病原，进一步取病变典型的组织，提取组织DNA，用针对ALV-A、ALV-B、ALV-J和MDV、REV的两组Multi-PCR分别进行检测，结果仅扩增出与ALV-J和REV前病毒对应的核酸条带，排除了ALV-A、ALV-B及MDV的感染，最后确诊该鸡群为ALV-J和REV混合感染。

图2 Multi-PCR电泳图

M：DNA Marker DL-2 000； 1：ALV-A/B/J Multi-PCR阳性对照；2：样本ALV-A/B/J DNA Multi-PCR； 3：ALV-A/B/J阴性对照；4：MDV/REV阳性对照； 5：MDV/REV阴性对照；6：样本DNA MDV/REV Multi-PCR

本次试验的结果表明，湖北地区所饲养的一些土鸡中存在ALV-J和REV的混合感染，应引起土鸡养殖者的重视，在引进鸡苗时需要提高警惕，同时还需加强ALV-J和REV的净化工作。

[1] 张洪海，刘青，邱波，等．地方柴鸡中J亚群禽白血病与马立克氏病的混合感染[J]．畜牧兽医学报，2009，40(8)：1215-1221．

[2] 宿靖伟，滕蔓，罗俊，等．马立克病毒与网状内皮增生病病毒的混合感染及在传代过程中的重组[J]．畜牧兽医学报，2016，47(1)：128-134．

[3] 梁雄燕，杨玉莹，顾玉芳，等．湖北部分肉种鸡群J亚群禽白血病血清学调查及PCR检测[J]．湖北农业科学，2009，48(11)：2636-2638．

[4] Gao Q 1, Yun B, Wang Q,etal. Development and application of a multiplex PCR method for rapid differential detection of subgroup A, B, and J avian leukosis viruses[J]. J Clin Microbiol, 2013, 52(1):37-44.

[5] Sathish G, Parthiban M, Kumanan K,etal. Differential detection of avian oncogenic viruses in poultry layer farms and turkeys by use of multiplex PCR[J]. J Clin Microbiol, 2012, 50(8): 2668-2673.

[6] 秦立廷，高玉龙，潘伟，等．我国部分地区蛋鸡ALV-J及与REV、MDV、CAV混合感染检测[J]．中国预防兽医学报，2010，32(2)：90-93．

2016-05-30

国家自然科学基金项目(31060342)

刘兰(1992-)，女，硕士，主要研究方向为动物病原分子生物学，E-mail： liulan222@hotmail.com

杨玉莹，E-mail：yangyycn@gmail.com

S858.31

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0529-6005(2017)04-0047-02