赵倩楠，应 雪，李晓泉，张 珂，李晓宁，梁晶晶，罗廷荣

(1.广西大学动物科学技术学院动物传染病研究室，广西南宁530004 ；2.广西大学亚热带农业生物资源保护利用国家重点实验室，广西南宁530004)

猪MAVS基因原核表达载体的构建及其多克隆抗体的制备

赵倩楠1,2，应 雪1,2，李晓泉1,2，张 珂1,2，李晓宁1,2，梁晶晶1,2，罗廷荣1,2

(1.广西大学动物科学技术学院动物传染病研究室，广西南宁530004 ；2.广西大学亚热带农业生物资源保护利用国家重点实验室，广西南宁530004)

通过RT-PCR从PK-15细胞系中扩增克隆MAVS(mitochondrial antiviral signaling protein)基因，构建原核表达载体pET-MAVS220，转化感受态细胞Rosetta(DE3)，利用IPTG诱导表达，重组MAVS经纯化后免疫4周龄昆明系小鼠制备抗线粒体抗病病毒信号蛋白(MAVS)多克隆抗体。诱导表达的最佳条件为IPTG 0.05 mmol/L，37 ℃诱导6 h，重组MAVS以可溶性蛋白和包涵体两种形式表达。应用该重组蛋白免疫小鼠获得的抗MAVS多克隆抗体与纯化的重组MAVS蛋白反应效价可达1∶16 000；该抗体与Poly(I∶C)刺激PK-15细胞产生的MAVS及与转染了重组MAVS基因真核表达载体pcDNA3.0-MAVS的BHK-21细胞表达的MAVS蛋白发生特异性反应，效价可达1∶1 000，特异性良好。

猪MAVS ； 原核表达 ； 多克隆抗体

固有免疫是机体抵抗外来病毒等微生物入侵的第一道防线。线粒体抗病病毒信号蛋白(mitochondrial antiviral signaling protein，MAVS)是RLR(RIG-I-like receptor)信号通路中关键的接头蛋白[1]。在病毒感染过程中，胞内受体RLR识别病毒dsRNA，经MAVS传递引起下游NF-κB和IRF-3等一系列细胞因子的激活[2]，从而诱导机体抗病病毒免疫反应[3]。NLR家族的NLRX1(又叫NOD9)定位于线粒体外膜，能与MAVS相互作用，抑制MAVS介导的抗病病毒免疫反应[4]。EYA4(eyes absent 4)与MAVS结合并对MAVS介导的IFN-β的表达至关重要[5]。SARS-CoV的ORF3b和ORF6两个蛋白定位于线粒体，可以与RIG-1或者MAVS结合从而抑制IFN的产生[6]。HCV通过具有Ser-蛋白酶体活性的NS3/4切割MAVS第508位半胱氨酸，造成MAVS不能正确定位在线粒体外膜上，不能诱导产生Ⅰ型干扰素，成为HCV逃避宿主免疫机制的策略之一[7-8]。

目前，养猪业是我国重要的支柱产业之一，但常受到猪瘟病毒、猪呼吸与繁殖障碍病毒、口蹄疫病毒等的侵害，造成巨大的经济损失。为了进一步研究猪体内MAVS在病毒感染过程中的免疫应答作用，需要应用抗猪MAVS抗体，而该抗体正是目前全世界的生物制品市场中所缺乏的。本试验通过构建猪MAVS基因原核表达载体，表达纯化出重组MAVS蛋白，免疫小鼠从而制备获得特异性高的抗猪MAVS多克隆抗体，为进一步研究猪MAVS与猪病毒性疾病之间的相互作用机制奠定良好基础。

1 材料与方法

1.1 主要试验材料 PK-15细胞系、BHK-21细胞系、pET-32 a(+)质粒由广西大学亚热带农业生物资源保护利用国家重点实验室保存提供；4周龄昆明系小鼠，购自广西医科大学实验动物中心。

1.2 引物设计与合成 根据GenBank中发表的猪MAVS基因序列(登录号：NM_001097429)，对MAVS多肽的亲疏水性和线性表位等指标进行了分析，选取MAVS基因序列1 018～1 677共660 bp作为原核表达的目的基因，设计亚克隆引物F：5′-cggaattcagcatggtgccctctaaa-3′；R：5′-cgctcgagatgatgatgatgatgatgccacggagccctagcctc-3′。

1.3 构建原核表达载体pET-MAVS220 本实验室前期经RT-PCR从PK-15细胞中扩增出全长MAVS基因，克隆至pMD18-T载体并构建了其真核表达载体pcDNA3.0-MAVS(添加了c-Myc标签)。用分别带有酶切位点EcoRI与XhoI的引物F和R对重组质粒pMD18-T-MAVS进行PCR扩增，连接pMD18-T载体，获得重组质粒pMD18-T-MAVS220，将其双酶切后亚克隆至原核表达载体pET-32 a(+)，PCR鉴定和酶切鉴定后菌液送测。

1.4 重组蛋白的表达及纯化 将pET-MAVS220转化至Rosetta(DE3)感受态细胞中，37 ℃ 200 r/min培养至菌液光密度值(OD600)达0.6，加入IPTG至终浓度分别为0.05 mmol/L和0.50 mmol/L，37 ℃诱导6 h。取诱导表达产物进行SDS-PAGE电泳分析，以确定目的蛋白原核表达的最佳条件。超声波破碎法裂解菌体，离心后分别收集上清与菌体沉淀进行SDS-PAGE电泳分析，鉴定重组蛋白的表达形式。然后用Ni-NTA亲和层析柱纯化可溶性蛋白。

1.5 猪MAVS多克隆抗体制备 纯化蛋白透析后与弗氏佐剂混合乳化免疫4周龄昆明系小鼠，采用第1、7、21、35天背部皮下多点注射的方式进行免疫，每只小鼠蛋白免疫量约500 μg。三免后第7天随机选一只小鼠收集少量血清，Western-Blot检测多克隆抗体与重组蛋白的反应性，鉴定小鼠是否产生特异性抗体。四免后第7天采血，收集血清。

1.6 多克隆抗体与猪MAVS特异性鉴定 培养BHK-21细胞至融合状态时参照脂质体2 000转染试剂盒说明书转染pcDNA3.0-MAVS真核表达载体，转染后24 h收集细胞总蛋白进行Western-Blot。培养PK-15细胞至融合状态时加入50 μg Poly(I∶C)刺激细胞，24 h后收集细胞总蛋白进行Western-Blot。

2 结果

2.1 原核表达载体pET-MAVS220构建 利用引物F和R，对重组质粒pMD18-T-MAVS进行PCR扩增，构建获得pMD18-T-MAVS220重组质粒，将其双酶切后连接pET-32 a(+)，转化感受态细胞TOP10，PCR鉴定结果为阳性(图1A)，质粒双酶切也得到预期目的条带(图1B)，测序结果正确。

图1 猪MAVS原核表达载体的鉴定

2.2 重组菌诱导及其表达形式的鉴定 取未诱导及诱导的重组菌菌液各1 mL离心，菌体处理后用于SDS-PAGE电泳，结果表明，重组载体表达出约43 kD的融合蛋白，且IPTG终浓度为0.05 mmol/L时诱导表达效果较好(图2)。诱导的重组菌超声波破碎后分别收集上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳，结果表明，37 ℃、IPTG 0.05 mmol/L时，获得的重组蛋白以可溶性蛋白和包涵体两种形式表达，且可溶性蛋白稍多于包涵体，而IPTG终浓度为0.5 mmol/L时重组蛋白仅以包涵体形式表达(图2)。

2.3 重组蛋白的纯化与鉴定 将Ni-NTA亲和层析纯化过程中收集的上清、穿透液、2次洗涤液、5次蛋白洗脱液进行SDS-PAGE电泳，结果表明，目的蛋白与Ni-NTA亲和层析柱结合良好；含70 mmol/L咪唑的wash buffer可洗涤部分杂蛋白，达到洗涤目的；含250 mmol/L咪唑的Elution Buffer可以洗脱全部目的蛋白(图3A)。Western-Blot鉴定透析后洗脱蛋白的His标签(图3B)，说明成功获得MAVS重组蛋白。

图2 SDS-PAGE分析重组菌pET-MAVS220表达的MAVS

图3 纯化MAVS重组蛋白的SDS-PAGE分析

A：纯化MAVS重组蛋白的SDS-PAGE分析 B：Western-Blot鉴定纯化的MAVS重组蛋白 M：蛋白分子量标准； 1：重组菌裂解后上清中的MAVS蛋白；2：穿透液； 3、4：70 mmol/L咪唑洗涤液； 5-9：250 mmol/L咪唑洗脱液回收的MAVS蛋白； 10：纯化后的MAVS重组蛋白

2.4 猪MAVS多克隆抗体与重组蛋白的反应性 将小鼠三免血清按不同比例稀释与MAVS重组蛋白反应进行Western-Blot，结果表明，MAVS多克隆抗体与MAVS重组蛋白的反应性很好，可达1∶16 000稀释(图4)。

2.5 多克隆抗体与真核细胞表达蛋白MAVS的特异性 收集转染pcDNA3.0-MAVS真核表达载体的BHK-21细胞蛋白和Poly(I∶C)处理的PK-15细胞蛋白进行Western-Blot，成功检测到BHK-21细胞表达的MAVS蛋白(图5A)和PK-15细胞表达的MAVS蛋白(图5B)，多克隆抗体效价可达1∶1 000，表明制备的抗猪MAVS多克隆抗体特异性良好。

图4 Western-Blot检测MAVS多克隆抗体与MAVS重组蛋白的反应性

图5 Western-Blot检测MAVS多克隆抗体与真核细胞表达MAVS蛋白的特异性

3 讨论

猪MAVS基因ORF编码一个由524个氨基酸构成的跨膜蛋白，其N端含有一个CARD结构域。RIG-Ⅰ和MDA5识别入侵病毒的RNA后，通过CARD结构域与接头蛋白MAVS直接相互作用，将信号传递到下游。由此可见MAVS在RLR信号。通路中的作用至关重要。本研究对猪MAVS基因编码蛋白的抗原指数和亲水性以及线性表位等指标进行了分析，同时考虑到原核表达系统中长片段外源基因的插入可能导致目的蛋白不表达或表达量低，故选取猪MAVS基因序列1 018～1 677共660 bp作为目的基因。片段与表达载体上的6×His-tag融合，表达出一个约43 kD的硫氧还原融合蛋白，从而提高可溶性蛋白的产量，同时利于Ni-NTA亲和层析纯化蛋白。

猪MAVS与人MAVS的氨基酸同源性很低，只有48.8%，而生物市场上又缺乏商品化的抗猪MAVS抗体。本研究成功对猪MAVS基因进行了克隆和原核表达，并制备出具有较高特异性的小鼠抗猪MAVS多克隆抗体，该抗体与大肠杆菌表达的重组MAVS蛋白反应效价可达1∶16 000，与真核细胞PK-15和BHK-21表达的MAVS蛋白反应效价可达1∶1 000，为进一步研究猪MAVS与猪病毒性疾病之间的相互作用机制奠定了基础。

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Antigenic specificity ofswine MAVS by prokaryotic expression and its preparation of polyclonal antibody

ZHAO Qian-nan1,2，YING Xue1,2，LI Xiao-quan1,2，ZHANG Ke1,2，LI Xiao-ning1,2，LIANG Jing-jing1,2，LUO Ting-rong2

(1.Laboratory of Animal Infectious Diseases， College of Animal Science and Technology, Guangxi University，Nanning 530004， China； 2.State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources,Guangxi University， Nanning 530004， China)

The MAVS gene was amplified from PK-15 cells by RT-PCR and was then subcloned into the prokaryotic expression vector to construct pET-MAVS220.The pET-MAVS220 was transfected into anE.coliRosetta(DE3) to express the recombinant MAVS via IPTG induction.The recombinant MAVS was purified and used to immunize the four-week Kunming mice to prepare anti-MAVS polyclonal antibody.The constructed recombinant vector pET-MAVS220 was transformed intoE.coliRosetta(DE3) cells and the MAVS was expressed by induction of 0.05 mM IPTG at 37 ℃ for 6 h.The recombinant MAVS was identified in two forms of soluble protein and/or inclusion body.The purified MAVS was used to immunize the four-week Kunming mice to prepare a polyclonal antibody.The reactivity of the anti-MAVS polyclonal antibody with prokaryotic expressed MAVS was identified to reach a high dilution of 1：16000，and reach a dilution of 1:1000 with MAVS expressed in eukaryotic PK-15 cells by poly(I:C) and in BHK-21 cells transfected with the eukaryotic vector pcDNA3.0-MAVS.The anti-swine MAVS polyclonal antibody showed a high reactivity and specificity.

Swine MAVS; Prokaryotic expression; Polyclonal antibody

LUO Ting-rong

2015-10-21

广西自然科学基金重点项目(2012GXNSFDA053009)；国家自然科学基金项目(31460653)

赵倩楠(1989-)，女，硕士，研究方向为动物传染病防治与分子病毒学，E-mail：524656052@qq.com

罗廷荣，E-mail：129478375@qq.com

S858.28

A

0529-6005(2017)04-0039-03