郑 成，谢梦利，胡罗红，罗 锐，金梅林，张安定

(1.华中农业大学动物医学院，湖北武汉430070 ； 2.农业部兽用诊断制剂创制重点实验室，湖北武汉430070)

肉鸡养殖场以心包积液为特征病例的诊断

郑 成1，2，谢梦利1，胡罗红1，罗 锐1，2，金梅林1，2，张安定1，2

(1.华中农业大学动物医学院，湖北武汉430070 ； 2.农业部兽用诊断制剂创制重点实验室，湖北武汉430070)

自2014年以来，出现了一种以发生于28～35日龄、发病急、病死率高、剖检可见心包积液、肝脏坏死、肾脏肿大、出血为特征的鸡急性传染病的病例。本研究通过其中一例典型病例的病原分离鉴定研究，发现禽腺病毒检测为阳性。进一步通过禽腺病毒的动物回归试验、病理组织切片分析等，结果发现，该病毒可引起鸡出现相似的临床发病特征和病理变化特征。通过对病毒的hexon基因序列及推导的氨基酸序列进行分析，其与血清4型的同源性最高。因此，确定该病的病原为禽腺病毒血清4型，也确认鸡心包积水综合征在我国肉鸡场的发生和流行。

鸡 ； 心包积液 ； 禽腺病毒血清型4型

鸡心包积水综合征最早报道于1988年，是Jaffery和Khawaja分别在巴基斯坦和印度发现的一种引起3～7周龄肉鸡高死亡率(70%)的新病[1]。病变特征是心包内蓄积有草黄色水样或果胨状物，并伴有肝脏肿大、质脆、色淡，核内有嗜酸性或嗜碱性包涵体，肾充血。其后日本[2-3]、韩国[4]等国均先后报道了这种有严重心包积水的综合征[5]。

2014年，华中农业大学农业部兽用诊断制剂创制重点实验室发现某肉鸡养殖场出现了鸡急性传染病的病例。该病主要发生于生长速度快的肉鸡，发病率为30%～50%，发病时病鸡精神沉郁，采食下降，聚堆趴窝，排出黄绿色稀粪，严重者死亡。剖检死亡鸡，可见心包有2～8 mL黄褐色积液，肝脏、肾脏肿大、出血，盲肠扁桃体出血。取病死鸡的组织固定、制作切片、染色观察。通常可见肝脏、肾脏和心脏均有明显的炎性细胞浸润、变性和坏死。为了确诊该病，我们进行了病原分离、鉴定以及动物回归试验研究，确诊该病为禽腺病毒血清型4型感染所致。

1 材料与方法

1.1 试剂、抗原和试验动物 TRIZol、AMV、RNA酶抑制剂、rTaqDNA聚合酶、dNTP混合物、DNA提取试剂盒，均购自宝生物工程(大连)有限公司。SPF鸡胚、SPF鸡来自于山东种鸡场。新城疫、禽流感等疾病标准抗原及PCR引物由本实验室保存。其他化学试剂均本国产分析纯试剂。

1.2 病原分离 从典型的发病鸡的心脏、肝脏、脾脏、肾脏等组织，剪碎并以1∶1比例加入无菌PBS匀浆，制成组织悬液，冻融后，8 000 r/min离心5 min，上清用PBS按1∶1 000稀释，经0.22 μm微孔膜过滤，滤液经卵黄接种6日龄SPF鸡胚，0.2 mL/胚，37 ℃孵育，每天观察，取出死胎，观察胚胎病变，收集死亡胚胎尿囊液作为毒种[6]。

1.3 病原鉴定

1.3.1 RT-PCR和PCR 将发病鸡的心脏、肝脏、肾脏、脾脏及其他病变器官剪碎，加入无菌PBS匀浆，制成组织悬液，冻融后离心取上清，提RNA、反转录cDNA，分别用高致病性禽流感病毒(HPAIV)、新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)和传染性腔上囊病毒(IBDV)的特异性引物进行RT-PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳鉴定结果。

提组织悬液的基因组，参照文献[7-8]，用禽腺病毒(FAV)特异性引物FAVHL和FAVHR进行PCR扩增，目的片段大小为728 bp，琼脂糖凝胶电泳鉴定结果。

FAVHL:5′-GACATGGGGTCGACCTATTTCGACAT-3′；FAVHR:5′-AGTGATGACGGGACATCAT-3′。

1.3.2hexon的克隆、测序及同源性分析 参照文献[9]，hexon基因序列设计引物FADV-serotypeF和FADV-serotypeR，PCR扩增特异片段，经测序，利用DNAman软件，将分离获得的毒株基因(SD)和腺病毒(FAV)不同血清型基因序列转换为氨基酸序列，并进行同源性比对分析，绘制系统进化树。

FADV-serotypeF：5′-CAARTTCAGRCAGACGGT-3′；FADV-serotypeR：5′-TAGTGATGMCGSGACATCAT-3′。1.4 动物回归试验 将10只购买的30日龄SPF白羽鸡随机分成两组，攻毒组和对照组各5只。饲养一周后，进行病毒的感染试验。攻毒组每只鸡颈部皮下接种由无菌PBS按1∶10稀释的毒种0.2 mL，对照组每只鸡按同样方式接种等量无菌PBS。攻毒后，鸡只正常饲养，观察两周并记录发病和死亡情况。动物死亡后，立即剖检，观察组织器官病变，分离病原，PCR检测FAV-4是否为阳性。

2 结果

2.1 病鸡剖检 某肉鸡场出现了一种以发生于28～35日龄、发病迅速、病死率高、剖检可见心包积液、肝脏坏死、肾脏肿大、出血为特征的鸡急性传染病的病例。为了确诊该病，取新鲜死亡样本剖检。结果发现，如中插彩版图1所示，心包有2～8 mL黄褐色清亮积液，腹腔有黄色胶胨样渗出，肝脏、肾脏肿大、出血，十二指肠有出血点，盲肠扁桃体肿大、出血。

将病死鸡的组织固定、制作切片、H.E.染色观察。发现肝组织局部区域坏死，坏死灶细胞核消失，胞浆淡染。脾组织结构紊乱，红髓与白髓界限模糊，白髓区，细胞排列散乱。肾小管上皮细胞水肿，肾小管上皮细胞部分细胞核固缩，胞浆出现空腔。心肌纤维间隙水肿，胞浆淡染，可见较多空泡；心肌间隙可见炎性细胞浸润(中插彩版图2)。

2.2 病原分离与鉴定 鉴于该病的临床症状，初步怀疑该病为高致病性禽流感病毒(HPAIV)、新城疫病毒(NDV)、传染性腔上囊病病毒(IBDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)和禽腺病病毒(FAV)感染所引起。因此，将病料提RNA，RT-PCR扩增HPAIV、NDV、IBV和IBDV；提病料的基因组，PCR扩增FAV。琼脂糖凝胶电泳结果显示，HPAIV、NDV、IBDV、IBV结果为阴性，FAV结果呈阳性。说明该心包积液病例不是感染HPAIV、NDV、IBV和IBDV，很可能是由于感染了禽腺病病毒(FAV)所致。

2.3 病原分离与鉴定 由于FAV血清型众多，而且其血清型的划分依赖于hexon抗原性差异。参考文献[9]，对hexon进行扩增及测序。我们利用hexon基因氨基酸同源性绘制的系统进化树(图3)，通过比较分离毒株(SD)hexon基因氨基酸序列与其他血清型之间的同源性，发现本毒株与腺病毒血清型4型同源性最高，为96%。因此，该毒株应该为血清型4型。

图3 FAV不同血清型毒株的进化树图

2.4 分离病毒的动物回归试验 将分离到的病毒感染SPF鸡进行本动物回归试验，发现攻毒组所有鸡在攻毒后第3天均出现精神极度沉郁，不饮不食，趴窝，其中3只迅速死亡，第4天，攻毒组完全死亡，而对照组鸡无明显发病表现(图4)。攻毒组鸡的发病特征与鸡场发病的特征相似，说明FAV-4很可能是导致肉鸡场鸡发病甚至死亡的原因。

图4 攻毒组1(FAV-4)和对照组1(PBS)的存活率

剖检攻毒组死鸡可见，心包有2～5 mL黄褐色清亮积液，腹腔有胶胨状黄色渗出，肝脏、肾脏和脾脏出血、肿胀，盲肠扁桃体出血，十二指肠出血，直肠末端有针尖状出血点，与肉鸡场案例中的临床特征一致。

而且所有攻毒组死亡鸡均分离到FAV-4。进一步确定了FAV-4是导致该肉鸡养殖场心包积水病例的病原。

3 讨论

禽腺病毒4型是引起肉鸡包涵体肝炎-心包积水综合征的特异病原体，目前已经成为全球肉鸡生产中的一个严重问题。自2014年，我国山东、湖北和河南等地养鸡场也有报道类似病例的发生[10]，对我国养禽业构成巨大的威胁，因此，该病例的诊断和防治十分必要。

2014年，华中农业大学农业部兽用诊断制剂创制重点实验室发现类似病例，通过RT-PCR和PCR进行病原学检测，结果显示，HPAIV、NDV、IBDV、IBV为阴性，FAV结果呈阳性。通过对病毒的hexon基因序列及推导的氨基酸序列进行分析，确定其血清分型为腺病毒血清型4型。通过动物回归试验，发现可引起相似的临床症状与病变，并且在攻毒组病死鸡中也分离出FAV-4病毒。从而确诊了以心包积液为特征的传染病的病原为FAV-4。

另外，有文献报道FAV-4单独不致病，只有在鸡感染传染性腔上囊病病毒或者传染性贫血病毒时才会导致鸡心包积液综合征的发生[11]。而本试验发现，在未感染其他病毒时，FAV-4也能导致鸡心包积液综合征的发生，并且发病迅速，死亡率高。当然，对于在感染传染性腔上囊病病毒或者传染性贫血病毒时，对腺病毒感染的影响，值得后续进一步深入研究。心包积液综合征已经对国内发病地区的养鸡行业造成的极大的经济损失，应予以重视。

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Diagnosis of an Infectious Disease Characterized with Hydropericardium in Broiler Farm

ZHENG Cheng1，2，XIE Meng-li1，HU Luo-hong1，LUO Rui1，2，JIN Mei-lin1，2，ZHANG An-ding1，2

(1.College of Veterinary Medicine，Huazhong Agricultural University , Wuhan 430070 , China 2.Key Laboratory of development of veterinary diagnostic products，Ministry of Agriculture，Wuhan 430070，China)

Since 2014，we have noticed that a new chicken disease emerged in the broiler farms，which is characterized by an acute outbreak at 28-35 days of age，high mortality with pericardial effusion，liver necrosis，renal swelling and bleeding.In the present study，one of the typical case of the diseases was selected for the identification of the pathogen.Fowl adenovirus was detected by PCR.The isolated virus caused similar clinical signs and pathological changes in chickens during the animal regression test.According to gene sequence and the deduced amino acid sequence ofhexon，the isolated virus showed high homology to serotype 4.Based on the study，we conclude that the pathogen of the hydrocephalus syndrome is fowl adenovirus serotype 4.

Chicken; Hydropericardium; Fowl adenovirus serotype 4(FAV-4)

ZHANG An-ding

2016-06-02

郑成(1993-)，女，硕士生，研究方向为动物传染病学，E-mail:zhengcheng@webmail.hzau.edu.cn

张安定，E-mail:andye8019@126.com

S855.3

A

0529-6005(2017)04-0036-03