陆子音，连凯霞，李继昌

(东北农业大学动物医学学院 ，黑龙江哈尔滨150030)

黄芩苷对黏菌素致小鼠周围神经毒性的保护作用研究

陆子音，连凯霞，李继昌

(东北农业大学动物医学学院 ，黑龙江哈尔滨150030)

黏菌素的神经毒性是众所周知的。中药黄芩苷具有抗氧化、保护神经等作用。本试验通过设定正常组(生理盐水)、模型组(静脉注射15 mg/kg体重 黏菌素)、黄芩苷高剂量组(200 mg/kg体重 黄芩苷+15 mg/kg 黏菌素)、黄芩苷中剂量组(100 mg/kg体重黄芩苷+15 mg/kg 体重黏菌素)和黄芩苷低剂量组(50 mg/kg体重 黄芩苷+15 mg/kg 体重黏菌素)共5个剂量组，连续给药7 d后，进行氧化-抗氧化相关生化指标测定(MDA、SOD、CAT和GSH)、坐骨神经组织中凋亡相关因子表达(Caspase3和Bax)及碱性髓鞘蛋白(myelin basic protein, Mbp)表达的测定。结果表明，黄芩苷干预组的小鼠氧化指标明显降低，提高小鼠的抗氧化能力；Caspase3和Bax以及Mbp蛋白表达量均有降低。

黄芩苷 ； 黏菌素 ； 神经毒性

黏菌素是一类多黏芽孢杆菌亚种代谢所孕育的碱性肽多糖类抗生素[1]。抗菌谱较窄，只作用于革兰阴性细菌[2 -3]。临床上主要应用的黏菌素种类包括具有药物活性的硫酸黏菌素和以非活性药的形式存在的甲磺酸黏菌素。据报道，黏菌素是治疗多重耐药革兰阴性细菌的有效药物，但黏菌素潜在的神经毒性严重影响其临床上的治疗效果[4]。虽然神经毒性的发生几率较之肾毒性小，但神经毒性的存在也严重危害黏菌素的临床应用。

黄芩苷是从黄芩的干燥根提取的一种黄酮类化合物，具有多种药理作用，如抗氧化、保护神经、抗肿瘤、镇静、抗病原微生物、免疫调节、抗炎症、保肝利胆、抗过敏等。但目前对黄芩苷神经保护作用的研究主要集中在脑神经，尚未见其对黏菌素所致的周围神经毒性的保护作用研究。

本试验的目的主要是在已经建立起来的黏菌素神经毒性小鼠模型的基础上，对小鼠应用不同剂量的黄芩苷进行干预，通过神经行为学、神经电生理、氧化抗氧化及蛋白免疫印迹等试验方法来探讨黄芩苷对黏菌素所诱导的神经毒性的保护作用及其作用机制的初探。

1 试验材料

1.1 实验动物 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心购买体重18～22 g雌性健康昆明系小鼠(许可证号：黑B2-20150878)。

1.2 主要试剂 黄芩苷提取物(舒泰神(北京)药业有限公司)；硫酸黏菌素(colistin sulfate)谷胱甘肽(GSH)检测试剂盒、总超氧化物歧化酶(T-SOD)检测试剂盒、过氧化氢酶(CAT)检测试剂盒、丙二醛(MDA)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)；Western Blot组织裂解液；兔抗鼠anti-Caspase3单克隆抗体；兔抗鼠anti-Bax单克隆抗体；兔抗鼠anti-Mbp单克隆抗体。

2 试验方法

2.1 实验动物分组 健康昆明系小鼠在动物房正常环境条件下(温度为25 ℃)，常规饲养1周。经过适应性饲养后，将其随机分为5组，即正常组、模型组、黏菌素+黄芩苷低剂量组(50 mg/kg体重+15 mg/kg体重)、黏菌素+黄芩苷中剂量组(100 mg/kg体重+15 mg/kg体重)、黏菌素+黄芩苷高剂量组(200 mg/kg体重+15 mg/kg体重)。模型组：15 mg/kg体重(每天分两次给药)剂量的黏菌素静脉注射；正常组：静脉注射等量的生理盐水；低剂量组：在黏菌素给药前0.5 h对小鼠进行腹腔注射黄芩苷50 mg/kg体重；中剂量组：腹腔注射黄芩苷100 mg/kg 体重；高剂量组：腹腔注射黄芩苷200 mg/kg体重；7 d后，对小鼠进行剖杀，取血清及坐骨神经，进行氧化-抗氧化指标测定及线粒体凋亡相关蛋白表达。2.2 小鼠血清及坐骨神经中氧化-抗氧化指标的测定 SOD含量的测定将所用试管分为测定管和一支对照管，按表1顺序加入所用试剂，对MDA、CAT及GSH含量的测定步骤同上。

表1 SOD含量的测定

充分混匀后，在室温放置10 min，于波长550 nm处，1 cm光径比色杯，蒸馏水调零，测定吸光度。

2.3 Western Blot检测小鼠坐骨神经线粒体途径凋亡相关蛋白表达 配置12% SDS-PAGE凝胶电泳分离胶，凝胶聚合后加入5%SDS-PAGE凝胶电泳积层胶。加入蛋白样本进行电泳，恒压80 V、40 min，样本进入分离胶后电压增加到120 V；120 V电压将蛋白转到PVDF膜上，1 h。TBS洗膜10 min后5%封闭液封闭1 h。封闭液稀释一抗后4 ℃孵育过夜(1∶150 兔抗鼠Caspase3、1∶200 兔抗鼠Bax和1∶200兔抗鼠Mbp)；TBST洗膜后二抗孵育1 h(1∶5 000羊抗兔IgG二抗)，TBST洗膜3次10 min/次，ECL显色。

3 数据处理

应用SPSS17.0软件包，对数据进行单因素方差分析，差异显著者再进行LSD检验。各组数据结果以平均数±S.D.表示，角标*及#表示两组数值比较差异显著(P<0.05)，角标**及##表示两组数值比较差异极显著(P<0.01)。

4 结果与分析

4.1 氧化-抗氧化试验

4.1.1 血清氧化-抗氧化指标的测定 图1可见，与对照组相比，模型组的血清生化指标中，氧化指标MDA的含量显著升高，差异极显著(P<0.01)，抗氧化指标SOD，GSH，CAT的含量显著降低；与模型组相比，黄芩苷低、中剂量组小鼠的氧化指标MDA的含量有所降低，高剂量组小鼠血清中MDA含量降低，差异极显著(P<0.01)；与模型组相比，抗氧化指标SOD，GSH，CAT的含量有不同程度的升高，高剂量组抗氧化指标大幅度升高，差异极显著(P<0.01)。而黄芩苷低剂量组与模型组相比，氧化指标MDA的含量无显著差异，抗氧化指标SOD，GSH，CAT的含量无显著差异。

图1 不同剂量的黄芩苷对黏菌素(15 mg/kg)处理的小鼠血清氧化-抗氧化指标的影响(n=10)A：正常组； B：模型组； C：黄芩苷低剂量组； D：黄芩苷中剂量组；E：黄芩苷高剂量组； **： P<0.01；##：P<0.01

4.1.2 坐骨神经中氧化-抗氧化指标的测定 由图2可见，与对照组相比，模型组的坐骨神经组织中氧化指标MDA的含量显著升高，差异极显著(P<0.01)，抗氧化指标SOD，GSH，CAT的含量显著降低，差异极显著(P<0.01)；与模型组相比，黄芩苷高剂量组小鼠坐骨神经组织中氧化指标MDA的含量显著降低，差异极显著(P<0.01)，抗氧化指标SOD，GSH，CAT的含量显著升高，差异极显著(P<0.01)。

图2 不同剂量的黄芩苷对黏菌素(15 mg/kg体重)处理的小鼠血清氧化-抗氧化指标的影响(n=10)A：正常组； B：模型组； C：黄芩苷低剂量组； D：黄芩苷中剂量组； E：黄芩苷高剂量组； **：P<0.01； ##：P<0.01

4.2 Western Blot检测蛋白表达 Western Blot分析不同剂量的黄芩苷对黏菌素所导致的小鼠坐骨神经中Caspase3、Bax及Mbp蛋白的变化，见图3。使用Image J软件分析各蛋白表达水平，见图4。结果发现，与正常组相比较，模型组的Caspase3、Bax蛋白表达量显著升高(P<0.01)；与模型组相比较，黄芩苷低剂量组未见显著区别；但黄芩苷中剂量组与模型组相比表达量降低，差异显著(P<0.05)，高剂量组差异极显著(P<0.01)。Mbp蛋白表达量的变化趋势与Caspase3及Bax蛋白的表达量变化基本一致，模型组Mbp相对表达量与正常组相比较，显著升高(P<0.01)；与模型组相比较，黄芩苷低、中剂量组均未见显著区别；但黄芩苷高剂量组与模型组相比较Mbp表达量降低，差异极显著(P<0.01)。

图3 黄芩苷不同剂量作用下Caspase3、Bax及Mbp蛋白的相对表达量变化(n=10)

图4 黄芩苷不同剂量作用下Caspase3、Bax和Mbp蛋白的相对表达量变化(n=10)**： P<0.01，与对照组相比； #： P<0.05，##： P<0.01，与模型组相比

5 讨论

Caspases家族在凋亡信号转导中起着核心作用。该家族一般分为两类：由Caspase2，8，9和10构成的启动式Caspases和由Caspases3, 6和7构成的效应式Caspase[8-9]。Caspase是调控凋亡的信号通路，并且是程序性死亡的主要代表蛋白。

Bax是Bcl-2家族中的促凋亡蛋白之一[10]，是最早发现的促凋亡因子，细胞质在亚细胞分级和免疫组织化学试验均表明，Bax在正常细胞中多以非活性单体形式分布于细胞浆，部分附着于线粒体表面。当有凋亡信号刺激时，Bax蛋白被激活且分子结构发生改变，并移位到线粒体插入膜表面并形成孔道，导致膜内外离子及蛋白浓度的平衡紊乱，从而发挥线粒体依赖的促凋亡作用[11]。本试验中，通过Western Blot试验发现，模型组小鼠的坐骨神经中Bax蛋白表达量和Caspase3蛋白的含量明显比正常组高(P<0.01)，这表明硫酸黏菌素可导致坐骨神经组织内Bax和Caspase3蛋白的显著增加。Bax蛋白作为线粒体膜通透性改变的重要因素之一，同时它的表达量增加可促进其下游因子Caspase3的活化，启动依赖Caspase凋亡的路径，从而发挥线粒体依赖的促凋亡作用。由此可以推断，当模型组小鼠静脉注射硫酸黏菌素后，Bax含量的增加，开启了Caspase3的凋亡途径，凋亡现象加剧[12]。

Mbp是富含碱性氨基酸的强碱性膜蛋白，存在于哺乳动物神经系统中，在中枢神经系统中由少突胶质细胞合成和分泌；在周围神经中，主要存在于周围神经髓鞘中，由雪旺细胞合成与分泌。除了神经组织之外，Mbp在肝、肺及肾上腺等组织器官中的含量较低[13]。Mbp处于髓鞘螺旋化的致密部，与髓鞘膜上带负电荷的脂质相互结合，保持髓鞘组织和功效的稳定性[14]。在成熟脊髓雪旺细胞上，Mbp是出现最晚的特异蛋白，并且在髓鞘的形成过程中具有启动作用。在周围神经损害时，Mbp水平的高低常能反应损害的程度。有研究表明，在周围神经受损失时，Mbp表达量的高低主要反映了有髓纤维髓鞘的数量和完整程度[15]。本试验结果显示，模型组坐骨神经中Mbp的表达量显著增加(P<0.01)，高于正常组的小鼠(即静脉注射等量生理盐水的小鼠)。由此我们得出，黏菌素所诱导的小鼠周围神经毒性能导致坐骨神经中有髓神经纤维的数量减少，并且能破坏有髓神经纤维的完整性，导致坐骨神经脱髓鞘现象的产生，与本课题前期研究结果吻合[4]。

小鼠血清及坐骨神经组织中氧化-抗氧化指标检测结果发现，黄芩苷低、中、高3个试验组小鼠的氧化指标(MDA)活性与模型组对比有不同程度降低，同时试验组小鼠抗氧化指标(SOD、CAT、GSH)的活性与模型组对比有所升高，并且黄芩苷高剂量组变化显著(P<0.01)。这提示，黄芩苷能通过抗氧化作用明显改善黏菌素所引起的小鼠氧化-抗氧化系统的紊乱，在一定程度上减少了神经损伤，从而起到保护作用，并具有剂量依赖性。

在Western Blot方法检测Caspase3、Bax及Mbp，不同试验组的小鼠坐骨神经中Caspase3和Bax蛋白表达量降低，与模型组比较，中、高剂量组小鼠体内坐骨神经中的Caspase3和Bax的表达均量显著降低(P<0.01)，最终导致相应线粒体途径的细胞凋亡的现象也会有不同程度的减少，也证实了黄芩苷具有保护坐骨神经免受神经毒的影响。与以上试验结果保持一致。据此推断，外源性黄芩苷进入机体后，可能通过抗氧化功能从而抑制神经细胞的凋亡相关信号通路，进而下调Caspase3和Bax的表达，通过调节线粒体信号通路，抵抗黏菌素对线粒体的损伤。Mbp活性量的高低主要反映了有髓纤维髓鞘的数量和完整程度。在黄芩苷预处理的试验组中，Mbp表达量降低，当剂量达到200 mg/kg体重时，Mbp的相对表达量与模型组相比降低，差异极显著。这一研究结果表明，黄芩苷能通过对抗黏菌素所诱导的小鼠坐骨神经脱髓鞘现象及增强坐骨神经有髓神经纤维的数量对神经起到保护作用。

6 结论

黄芩苷对黏菌素诱导的小鼠周围神经毒性具有保护作用，并且在200 mg/kg体重的剂量下保护效果最佳。其机制可能与黄芩苷的抗氧化有关，且黄芩苷的保护作用具有剂量依赖性。

[1] Bassetti M, Repetto E, Righi E,etal. Colistin and rifampicin in the treatment of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii infections[J]. Journal of antimicrobial chemotherapy, 2008, 61(2): 417-420.

[2] Falagas M E, Kasiakou S K, Saravolatz L D. Colistin: the revival of polymyxins for the management of multidrug-resistant gram-negative bacterial infections [J]. Clinical infectious diseases, 2005, 40(9): 1333-1341.

[3] Lim L M, Ly N, Anderson D,etal. Resurgence of colistin: a review of resistance, toxicity, pharmacodynamics, and dosing [J]. Pharmacotherapy, 2010, 30(12): 1279-1291.

[4] 代重山. 黏菌素神经毒性小鼠模型建立、机制探讨及NGF保护作用[D].哈尔滨：东北农业大学, 2013.

[5] LoPachin R M, Ross J F, Reid M L,etal. Neurological evaluation of toxic axonopathies in rats: acrylamide and 2, 5-hexanedione[J]. Neurotoxicology, 2002, 23(1): 95-110.

[6] Tillerson J L, Miller G W. Grid performance test to measure behavioral impairment in the MPTP-treated-mouse model of parkinsonism [J]. Journal of neuroscience methods, 2003, 123(2): 189-200.

[7] 贾晓枫, 陈中伟, 陈统一, 等. 应用自制神经束内微电极采集周围神经即时电信号[J].中国临床康复，2002，6(22)：3366-3367.

[8] Riedl S J, Shi Y. Molecular mechanisms of caspase regulation during apoptosis [J]. Nature reviews Molecular cell biology, 2004, 5: 897-907.

[9] Tait S W, Green D R. Mitochondria and cell death: outer membrane permeabilization and beyond[J]. Nature reviews Molecular cell biology, 2010, 11: 621-632.

[10] Yousef J M, Chen G, Hill P A,etal. Ascorbic acid protects against the nephrotoxicity and apoptosis caused by colistin and affects its pharmacokinetics[J]. Journal of antimicrobial chemotherapy, 2012, 67(2): 452-459.

[11] Tan K O, Fu N Y, Sukumaran, S K,etal. MAP-1 is a mitochondrial effector of Bax [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2005, 102 (41):14623-14628.

[12] Daugas E, Susin S A, Zamzami N,etal. Mitochondrio-nuclear translocation of AIF in apoptosis and necrosis[J]. FASEB J, 2000 Apr; 14(5):729-739.

[13] 贺玉君, 秦新民, 黄明, 等. 髓鞘碱性蛋白的研究及进展[J]. 广西中医学院学报, 2004, 7(2): 75-79.

[14] Boggs J M. Myelin basic protein: a multifunctional protein [J]. Cellular and Molecular Life Sciences CMLS, 2006, 63(17): 1945-1961.

[15] Brettschneider J, Petzold A, Süssmuth S,etal. Cerebrospinal fluid biomarkers in Guillain-Barré syndrome-Where do we stand?[J]. J Neurol, 2009 Jan; 256(1):3-12.

Baicalin Protects Against Colistin-induced Peripheral Neuro Toxicity in Mice

LU Zi-yin, LIAN Kai-xia, LI Ji-chang

(Northeast Agricultural University College of Animal Medicine, Harbin 150030, China)

Colistin-induced neurotoxicity is well-known. Baicalin has a lot of pharmacological effects, such as antioxidation, neuro-protection, et al. In this Study,mice were divided into five dose groups: normal group (saline), model group (intravenous colistin 15 mg/kg), baicalin high dose group (200 mg/kg baicalin +15 mg/kg colistin), and baicalin media dose group (100 mg/kg baicalin+15 mg/kg colistin), baicalin low dose group (50 mg/kg baicalin +15 mg/kg colistin). After 7 days of administration, we measured the oxidation-antioxidant, expression of apoptosis-related factors (caspase3 and Bax) and myelin basic protein detection in sciatic nerve. The results showed that: baicalin significantly reduced reactivity of oxygen indicators and improved the anti-oxidative capacity The expression of Caspase3, Bax and Mbp proteins were significantly decreased by baicalin.

baicalin; colistin; neurotoxicity

LI Ji-chang

2016-06-15

国家自然科学基金(31472240)

陆子音(1988-)，女，博士生，主要研究方向为兽医药理学与毒理学，E-mail:luziyin0217@sina.com

李继昌，E-mail：lijichang@neau.edu.cn

S852

A

0529-6005(2017)04-0013-04