廖勤丰，李文娟，向邦全，程文超，徐茂森，王 敬，谭素雯

(重庆三峡职业学院动物科技系，重庆万州404155)

三峡库区仔猪传染性腹泻病原调查

廖勤丰，李文娟，向邦全，程文超，徐茂森，王 敬，谭素雯

(重庆三峡职业学院动物科技系，重庆万州404155)

为了弄清三峡库区仔猪传染性腹泻病原的感染及流行规律，本试验于2013-2015年从三峡库区的18个规模化猪场采集了180份发生腹泻的病料进行猪致病性大肠杆菌(EPEC)、猪流行性腹泻病病毒(FEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病病毒(RDV) 4种病原的检测，结果表明，三峡库区6个地区4种仔猪腹泻传染性病原检出率由高至低顺序为PEDV、RDV、TGEV和EPEC，依次为22%、12.7%．5.5%和3.8%，表明三峡库区规模化猪场PEDV和RDV感染广泛，且三峡库区规模化猪场存在多种病原混合感染情况。

仔猪腹泻 ； 猪致病性大肠杆菌 ； 猪流行性腹泻病毒 ； 猪传染性胃肠炎病毒 ； 猪轮状病病毒

在规模化猪场，仔猪腹泻是一种典型的多因素性疾病。近年来，许多猪群仔猪腹泻性疾病的发病率高达50%以上，病死率高达15%～20%左右，由腹泻引起的仔猪死亡数占仔猪死亡总数的39.8%，其中哺乳仔猪至断奶前后发生腹泻而引起死亡的约占20%～25%[1-2]。2010年冬至2011年春，在我国华东、华南和华北部分省份，出现了流行范围广、疫情严重及危害严重的猪群腹泻性疫病，给养猪业造成了严重的经济损失[3]。

许多研究证明，引起仔猪腹泻的主要传染性病原有细菌性和病毒性两种，主要包括致病性大肠杆菌、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病病毒等[4-8]。为了弄清三峡库区仔猪传染性腹泻病原的感染及流行规律，本调查于2013-2015年从三峡库区的18个规模化猪场采集了180份发生腹泻的病料进行猪致病性大肠杆菌、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病病毒4种病原的检测，为三峡库区的仔猪传染性腹泻疫病的防治和流行病学提供科学依据。

1 材料

2013-2015年，在三峡库区的万州、开县、巫溪、云阳、忠县、奉节6个地区,从每个地区各选择3家规模化养殖场，在每个养殖场各采集腹泻仔猪的新鲜粪便10份，共180份样品用于本试验。

2 方法

2.1 致病性大肠杆菌的分离纯化 将腹泻仔猪的新鲜粪便样品无菌接种于麦康凯琼脂培养基上，于37 ℃培养24 h，挑取红色典型菌落于麦康凯琼脂培养基进行纯化培养，-20 ℃保存。

2.2 致病性大肠杆菌的PCR鉴定 参照文献[4-5]设计菌毛K88和K9的检测引物P1/P2和P3/P4(表1)，挑取纯化培养的菌落重悬1 mL于去离子水中作为PCR反应模板。建立25 μL PCR反应体系：2×PCR Super Mix 12.5 μL、上下引物(20 pmol / μL)各1 μL、模板5 μL；PCR程序为：在94 ℃预变性4 min，随后用94 ℃变性50 s、45 ℃退火50 s、72 ℃延伸90 s的程序运行30个循环，最后在72℃下延伸5 min，PCR产物用1.5 %琼脂糖凝胶电泳进行观察。

2.3 腹泻病毒性病原的检测

2.3.1 样品处理 将猪粪便样品用无菌PBS稀释按1∶5比例(w/v)稀释，加入双抗，研磨或振荡制成匀浆，13 800 r/min(4 ℃)离心10 min，取上清，用0.22 μm滤器过滤，将滤液置-20 ℃保存。

表1 试验所用的4种病原检测引物

2.3.2 RNA提取及cDNA模板制备 取200 μL上述滤液，用RNeasy Mini kit提取样品RNA，取5 μL RNA与20 pmol随机引物混合，在70 ℃作用5 min，置4 ℃作用5 min；然后依次加入5 μL 5×RT Buffer、5 μL dNTP(10 mmol/L)、7 μL RNA-free H2O、1μL M-MLV反转录酶(200 U/μL)、1μL RNase inhibitor(40 U/μL)，补ddH2O至25 μL。在42 ℃反应1 h，置94 ℃作用5 min。

2.3.3 PEDV、RDV、GEV的检测 用文献[6-8]报道的引物进行检测。建立25 μL PCR反应体系：2×PCR Super Mix 12.5 μL、PEDV、RDV、GEV的上下游引物(20 pmol/μL)(表1)各1 μL、cDNA模板5 μL；PCR程序参考文献[6-8]，PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行观察。

3 结果

3.1 致病性大肠杆菌的PCR检测结果 从7份发病猪场样本分离到的大肠杆菌，从7份样品中检出大肠杆菌K88的201 bp条带(图1)，RT-PCR阳性率为3.8%(表2)。

图1 大肠杆菌K88的PCR检测电泳图

M：DNA Marker； 1～5：部分样品K88的检测PCR产物；6：阳性对照； 7：阴性对照； 8～13：部分样品K88的检测PCR产物

3.2 PEDV、RDV、GEV的RT-PCR检测结果 从40份样品中检出PEDV的423 bp条带(图2)，RT-PCR阳性率为22%(表2)。从25份样品中检出RDV的750 bp条带(图3)，RT-PCR阳性率为13.8%(表2)。从10份样品中检出TGEV的546 bp条带，RT-PCR阳性率为5.5%(表2)。

图2 PEDV的PCR检测电泳图

M：DNA Marker； 1～13：部分样品PEDV的检测PCR产物； 14：阳性对照； 15：阴性对照； 16～22：部分样品PEDV的检测PCR产物

图3 PRV的PCR检测电泳图

M：DNA Marker； 1～3：部分样品PRV的检测PCR产物；4：阳性对照； 5：阴性对照； 6～10：部分样品PRV的检测PCR产物

3.3 腹泻病料中病原检测结果 2013-2015年，应用细菌分离、PCR及RT-PCR方法对收集于三峡库区6个地区的18个规模化猪场具有明显腹泻症状仔猪的180份病料样品，进行EPEC 、PEDV、TGEV、RV核酸检测，按不同地区进行比较(表2)，部分阳性病料PCR和RT-PCR检测电泳图(图1～图3)。阳性率由高至低顺序为PEDV、RDV、TGEV和EPEC，分别为22%、12.7%．5.5%和3.8%。PEDV从2013-2015年不同年份的阳性率依次为23.3%、26.7%、16.7%；RDV从2013-2015年不同年份的阳性率依次为8.33%、11.7%、21.7%；TGEV从2013-2015年不同年份的阳性率依次为0、5%、11.7%；EPEC仅在2013年检出11.7%。

表2 三峡库区仔猪腹泻4种病原检测结果

3.4 规模化猪场4种病毒混合感染检测结果 对收集于三峡库区6个地区的18个规模化猪场具有明显腹泻症状仔猪的180份病料样品，进行4种病原检测结果显示，其中1个猪场存在EPEC 、PEDV的混合感染，阳性样品为3份，阳性率为1．7%；另1个猪场存在PEDV与TGEV混合感染，阳性样品为4份，阳性率为2.2%；另外2个猪场存在PEDV与RDV混合感染，阳性样品为5份，阳性率为2.8%；还有1个猪场存在TGEV与RDV混合感染；阳性样品为3份，阳性率为1．67%；其余猪场均为单一感染(表2)。

3.5 各病原阳性地区分布 对三峡库区6个地区的病料样品的阳性结果进行分析，结果显示，万州、开县、巫溪、云阳、忠县、奉节6个地区的仔猪腹泻病料样品中均检出PEDV，其中万州和巫溪的PEDV感染率较高，万州PEDV阳性率为33.3%，巫溪PEDV阳性率为26.7%；除万州外检测出RDV，其中开县的感染率RDV最高为30%；TGEV只在万州、云阳及奉节3个地区检出，EPEC只在万州、云阳2个地区检出。

4 讨论

猪流行性腹泻最早发生于1976年[9]，此后猪流行性腹泻时有发生，而由2010年10月开始，中国南部地区超过10个省份暴发PED，并导致100万头以上的仔猪死亡[10]。杨绍林等[11]对2011-2012年期间四川地区7个县市的规模化养殖场仔猪腹泻疫情调查结果显示，猪流行性腹泻病毒阳性率为42.47%，并认为此次仔猪腹泻疫情的主要病原为猪流行性腹泻病毒。本调查对收集于三峡库区6个地区的18个规模化猪场具有明显腹泻症状仔猪的180份病料样品进行EPEC 、PEDV、TGEV、RV核酸检测，结果发现，三峡库区6个地区4种仔猪腹泻传染性病原检出率由高至低顺序为PEDV、RDV、 TGEV和EPEC，其中PEDV阳性率最高为为22%，表明三峡库区规模化猪场PEDV感染率高，三峡库区仔猪腹泻传染性主要病原为PEDV，其次为RDV。对4种病原3年间的流行情况分析表明，PEDV感染率在2014年达到高值，而在2015年其感染率开始下降，；RDV、TGEV感染率在从2013-2015年逐年上升；而EPEC仅在2013年检出。三峡库区规模化猪场4种病毒混合感染检测结果显示，万州有1个猪场存在EPEC 、PEDV的混合感染，奉节1个猪场存在PEDV与TGEV混合感染，巫溪和云阳各有1个猪场PEDV与RDV混合感染，表明三峡库区规模化猪场存在多种病原混合感染情况。本课题调研的三峡库区6个地区均检出PEDV，除万州外检出RDV，表明三峡库区规模化猪场PEDV和RDV感染广泛。

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Investigation on Pathogens with Causing piglet Diarrhea From Three Gorges Reservoir of Chongqing

LIAO Qin-feng , LI Wen-juan , XIANG Bang-quan , CHENG Wen-chao , XU Mao-sen ,WANG Jing , TAN Su-wen

(Department of Animal Science and Technology, Chongqing Three Gorges Vocational College, Chongqing 404155，china)

In order to investigate the pathogens and epidemics of piglet Diarrhea From Three Gorges Reservoir of Chongqing, we collected 180 occurred diarrhea feces samples from 18scale pigfarms in the Three Gorges Reservoir area from 2013 to 2015 .Using PCR or RT-PCR, those samples were detected for Enteropathogenic Escherichia coli(EPEC), Porcine epidemic diarrhea virus of swine (FEDV), Transmissible gastroenteritis virus of swine (TGEV) and Rotavirus of swine(RDV). The results showed that detection rate of PEDV,RDV, TGEV and EPEC were 22%, 12.7%, 5.5% and 3.8%,respectively.In six areas of Three Gorges Reservoir of Chongqing. The results also showed that diarrhea happened in large scaled pig farms in partial areas of Three Gorges Reservoir of Chongqing mainly resulted from PEDV, and RDV. Mixed infection was found in those areas.

piglet Diarrhea; Enteropathogenic Escherichia coli; Porcine epidemic diarrhea virus of swine; Tansmissible gastroenteritis virus of swine; Rotavirus of swine

2016-06-15

重庆市教委科学技术研究项目资助(KJ1733440)

廖勤丰(1980—)，男，副教授，博士，研究方向为兽医微生物与免疫学，E-mail：lqf1980love@126.com

S852.65+1

A

0529-6005(2017)04-0009-04