安翠红，陈宝宝，范锁平，孙养信，吕 文，鲁 亮



陕西省黄鼠的遗传学特征分析

安翠红，陈宝宝，范锁平，孙养信，吕 文，鲁 亮

目的 明确分布于陕西省的黄鼠的遗传学特征。方法 测定COI、Cyt-b基因序列，与内蒙古科右中旗、正镶白旗达乌尔黄鼠、宁夏海原县阿拉善黄鼠同类基因序列进行比对，分析遗传距离，构建系统发育NJ树。结果 陕西省定边县黄鼠COI基因序列与宁夏阿拉善黄鼠的遗传距离≤0.5%，与内蒙达乌尔黄鼠遗传距离在7.9%～9.3%之间，Cyt-b基因序列与宁夏阿拉善黄鼠的遗传距离为≤2.2%，与内蒙达乌尔黄鼠遗传距离在8.9%～11.2%之间。基于COI和Cyt-b基因的NJ系统树可见所有样本序列形成两个高支持度的单一分支，陕西定边县黄鼠与宁夏阿拉善黄鼠聚为一类，两者与内蒙达乌尔黄鼠形成两个独立分支, 基于COI基因的 NJ系统树显示陕西各地样本聚为一类。结论 陕西省的黄鼠应为阿拉善黄鼠。

黄鼠；DNA条形码；COI基因；Cyt-b基因；阿拉善黄鼠；陕西；达乌尔黄鼠

阿拉善黄鼠(Spermophilusalashanicus)曾是一个有争议的物种。20世纪中叶国内外学者多以其形态特征与达乌尔黄鼠(Spermophilusdauricus)相近，而将其归为达乌尔黄鼠的亚种[1-2]。对于这两种黄鼠的分类地位的讨论经历了很长时间。近年来，利用细胞生物学手段，国内外学者利用染色体核型来区分这两种黄鼠，这两种黄鼠的分类地位逐步明确[3-4]。

在陕西省的陕北、关中地区分布的黄鼠，多年来一直被认为是达乌尔黄鼠[5-6]。中国学者赵天飙、秦长育等多将分布于内蒙古南部和陕甘宁青及蒙古国西南部等地的阿拉善黄鼠视为达乌尔黄鼠的亚种[1-2]。上述区域中，涵盖了陕西北部地区的长爪沙鼠鼠疫疫源地和宁夏甘肃的阿拉善黄鼠鼠疫疫源地。小型兽类宿主动物的准确分类是鼠疫动物流行病学调查的重要内容。但这些地区的黄鼠到底是哪种，不仅是单纯分类学的问题，更是和公共卫生相关的分类学问题。

DNA条形码技术能够准确地评估物种和遗传多样性[8],并对生物多样性进行有效地监测[7-9]。

陕西省鼠疫疫区1987-2014年发生3起鼠间鼠疫，在疫情处理及监测过程中，经常会遇到一些形态学上很难鉴定的宿主动物。2012年课题组开展了DNA条形码技术在陕西鼠疫疫区应用研究[10]，现将结果报告如下。

1 材 料

陕西省定边县、大荔县、府谷县、靖边县、吴起县、宁夏海原县、内蒙古科右中旗、正镶白旗现场采集黄鼠鼠体和脏器标本。DB01-15采自定边县，DL01-10,13采自大荔县，WQ01-05采自吴起县，FG02-04，10采自府谷县，JB18，19采自靖边县。NX01-7采自宁夏海原县，NM49、50、52、53采自内蒙科右中旗，ZB01-17采自内蒙正镶白旗。

2 方 法

2.1 DNA模板的制备 现场采集的样本用无水乙醇保存带回，使用Qiagen公司生产QIAamp DNA Mini kit试剂盒操作手册制备DNA模板，测定其DNA含量。

2.2 PCR反应 线粒体细胞色素C氧化酶I亚基(COI)基因选用鸡尾酒引物[11]，其中LepF1_t1、VF1_t1、VF1d_t、VF1i_t1的比例为1∶1∶1∶3。LepRI_t1、 VR1d_t1、 VR1_t1、VR1i_t1的比例也是1∶1∶1∶3，见表1。在25 μL反应体系中, 2×Taq Mastermix 12.5 μL, 上下游引物各1 μL, 模板2 μL。扩增条件: 94 ℃预变性5 min, 94 ℃变性30 s, 55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸1 min, 共35个循环。Cyt-b基因引物序列为L14724 5′-CGAAGCTTGATATGAAAAACCATCGTTG-3′，H15915 5′-CGGAATTCCATTTTTGGTTTACAAGAC-3′，PCR扩增方法：50 μL PCR反应体中，2×Taq Mastermix25 μL,上下游引物各2 μL,模板4 μL。扩增条件为:94 ℃预变性3 min,94 ℃变性30 s,51 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共30个循环。PCR产物1.5%的琼脂糖凝胶电泳分析,若电泳图中出现目标条带即送样进行双向测序。

表1 扩增COI基因的PCR引物序列
Tab.1 Sequence of primers for amplifyingCOIgene

引物类型Typeofprimer引物名称Name引物序列(5'-3')Sequenceofprimers(5'-3')鸡尾酒引物(上游)VF1LFt1Cocktailprimer(upstream)VF1LFt1LepF1_t1TGTAAAACGACGGCCAGTATTCAACCAAT-CATAAAGATATTGGVF1_t1TGTAAAACGACGGCCAGTTCTCAACCAAC-CACAAAGACATTGGVF1d_tTGTAAAACGACGGCCAGTTCTCAACCAAC-CACAARGAYATYGGVF1i_t1TGTAAAACGACGGCCAGTTCTCAACCAAC-CAIAAIGAIATIGG鸡尾酒引物(下游)VR1LRt1Cocktailprimer(downstream)VR1LRt1LepRI_t1CAGGAAACAGCTATGACTAAACTTCTG-GATGTCCAAAAAATCAVR1d_t1CAGGAAACAGCTATGACTAGACTTCT-GGGTGGCCRAARAAYCAVR1_t1CAGGAAACAGCTATGACTAGACTTCT-GGGTGGCCAAAGAATCAVR1i_t1CAGGAAACAGCTATGACTAGACTTCT-GGGTGICCIAAIAAICA

2.3 DNA序列分析：用Chromos软件观察评价测序峰图质量, 如果峰图质量差，不能准确判断碱基, 则重新进行扩增和测序。将测定序列在NCBI上运行BLAST程序进行序列同源性比较。运用Mega 6软件比对各基因序列的碱基组成和变异,删除序列两端不能完全对齐的碱基。基于Kimura-2-parameter(K2P)[12]模型计算各物种的遗传距离；采用邻接法构建全部COI基因序列的NJ系统树,对NJ树进行内部分支检验与1,000次Bootstrap检验分析, 来确定各支系的置信度[13]。

3 结 果

3.1 DNA条形码技术检测结果与分析 对采自陕西省定边县、宁夏海原县、内蒙古科右中旗、正镶白旗的28份黄鼠样本进行DNA条形码技术检测。其中NM49、NM50、NM52、NM53采自内蒙科右中旗，其余内蒙样品采自正镶白旗。28份样本全部获得COI基因、Cyt-b基因序列。

3.2 基因序列分析 陕西定边黄鼠Cyt-b基因序列与宁夏阿拉善黄鼠的遗传距离为≤2.2%，与内蒙达乌尔黄鼠遗传距离在8.9%～11.2%之间，陕西各地黄鼠COI基因序列与宁夏阿拉善黄鼠的遗传距离≤2%，与内蒙达乌尔黄鼠遗传距离在8%～10%之间。

3.3 构建系统发育树 应用Mega 6软件构建NJ系统树,见图1、图2。图1COI、Cyt-b基因NJ系统树显示内蒙黄鼠与陕西定边、宁夏海原黄鼠分成两个独立分支，陕西定边黄鼠与宁夏海原黄鼠聚为一类。图2COI基因NJ系统树显示陕西各地黄鼠聚为一类。

图1 陕西定边与宁夏、内蒙古黄鼠COI、Cyt-b基因NJ系统树Fig.1 Neighbor-joining phylogenetic tree of COI and Cyt-b of the Citellus samples from Dingbian County in Shaanxi,Nigxia and Inner Mongolia

图2 陕西各地黄鼠COI基因NJ系统树Fig.2 Neighbor-joining phylogenetic tree of the Citellus samples from different places of Shaanxi Province

4 讨 论

线粒体(Mitochondria)是真核细胞中小分子量的复制单位, 由于其具有拷贝数多、分子量小、编码效率高、母系遗传和进化速度较核基因组快等特点[14], 近年来越来越多的被作为分子标记, 广泛应用到动物进化遗传学、分子生态学、遗传多样性、物种及品系鉴定等方面[15]。DNA 条形码是利用短的标准 DNA 序列来鉴定物种的一种行之有效的方法，因其片段小且易于获得而被广泛应用于多个物种的种类鉴定工作中。目前在动物分类中最常用的基因序列是线粒体细胞色素C氧化酶Ⅰ亚基(COⅠ)序列和Cyt-b基因序列。

据Hebert等对GenBank中同一个属的物种COI序列数据进行研究，结果表明种内的COI序列差异程度小于2%[9]。马英等对青海省海东地区小型兽类110只样本的COI基因进行序列分析, 发现种内遗传距离≤3%, 种间遗传距离5%～10%[16], 安翠红等对陕西鼠疫疫区139只宿主动物COI基因进行序列分析，发现种内遗传距离≤2%，种间遗传距离8.9%～15.1%[10]。

Meyer 的研究表明, 对于初步进行某些物种分子系统发育研究是可以首先采用线粒体细胞色素b 基因, 不仅它是13 个蛋白质编码基因中了解的最为清楚的基因, 也被认为是最可信的分子标记之一[17], 同时用保守引物扩增线粒体Cyt-b基因较其他线粒体基因要容易的多, 因此研究较为广泛[18]。已有研究表明线粒体Cyt-b基因在研究亲缘关系较近的物种分类阶元系统关系和种系地理学方面非常有用[19]。

本研究发现，陕西省定边县黄鼠COI基因序列与宁夏海原县阿拉善黄鼠的遗传距离≤0.5%，与内蒙达乌尔黄鼠遗传距离在7.9%～9.3%之间。Cyt-b基因序列与宁夏阿拉善黄鼠的遗传距离为≤2.2%，与内蒙达乌尔黄鼠遗传距离在8.9%～11.2%之间。NJ系统树显示陕西黄鼠与宁夏阿拉善黄鼠聚为一类，两者与内蒙达乌尔黄鼠形成两个独立分支。遗传距离与NJ系统树说明内蒙科右中旗、正镶白旗黄鼠和宁夏海原阿拉善黄鼠、陕西黄鼠为不同种，陕西黄鼠与宁夏海原阿拉善黄鼠为同种。

综上，依据COI、Cyt-b基因序列比对结果，表明陕西省的黄鼠为阿拉善黄鼠。

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Genetic characteristics ofSpermophilusin Shaanxi Province, China

AN Cui-hong, CHEN Bao-bao, FAN Suo-ping, SUN Yang-xin, LV Wen, LU Liang

(ShaanxiCenterforDiseaseControlandPrevention,Xi’an710054,China)

We studied the genetic characteristics ofSpermophilusin Shaanxi Province, China. TheCOI,Cyt-bgene were sequenced and the results were compared with those ofdauricusfrom Inner Mongolia Keyouzhong Banner and Zhengxiangbai Banner, andS.alaschanicusfrom Haiyuan County of Ningxia. And genetic distance was analyzed and Neighbor-Joining tree was built. Results showed that the genetic distance ofCOIgene sequences betweenSpermophilusfrom Dingbian County in Shaanxi andS.alaschanicusin Ningxia was ≤0.5%, and the genetic distance was ranged from 7.9% to 9.3% withCitellusdauricusfrom Inner Mongolia. The genetic distance ofCyt-bgene betweenSpermophilusfrom Dingbian County in Shaanxi andS.alaschanicusin Ningxia was ≤2.2%, and ranged from 8.9% to 11.2% withCitellusdauricusfrom Inner Mongolia. The Neighbor-Joining tree ofCOI,Cyt-bgene showed two major clusters. One of them were clustered bySpermophilusfrom Dingbian County in Shaanxi andS.alaschanicusin Ningxia, and another one wasCitellusdauricusfrom Inner Mongolia. The Neighbor-Joining tree ofCOIgene showed that all samples from Shaanxi Province clustered in a group. In conclusion, theSpermophilusin Shaanxi Province wereS.alaschanicus.

Spermophilus; DNA barcoding;COIgene;Cyt-bgene; Shaanxi Province;S.alaschanicus;S.dauricus

Sun Yang-Xin, Email: sxpco@126.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.06.013

孙养信，Email: sxpco@126.com

陕西省疾病预防控制中心，西安 710054

R394

A

1002-2694(2017)06-0538-04

2017-02-21 编辑：李友松

陕西省科学技术研究发展计划项目(No.2012K16-12-03)资助

Supported by a grant from the Science and Technology Research and Development Program of Shaanxi Province,(No. 2012K16-12-03)