梁洁怡，戴 俊，黎东红，师永霞*，黄吉城，袁 帅，郑 夔，李小波，张显光，宋卫，吴惠明



广东首例苏里南输入性寨卡病毒感染病例的实验室检测

梁洁怡1，戴 俊1，黎东红1，师永霞1*，黄吉城1，袁 帅1，郑 夔1，李小波1，张显光2，宋卫2，吴惠明2

目的 对从广州白云国际机场口岸入境的一例自苏里南归国发热人员进行寨卡病毒实验室检测。方法 采集发热人员的血液和唾液样本，同时使用两种寨卡病毒实时荧光RT-PCR试剂进行寨卡病毒核酸检测。RT-PCR扩增寨卡病毒部分基因片段，并进行序列测定和同源性比较。基于扩增片段构建系统进化树，分析输入性病例的来源。结果 实时荧光RT-PCR结果显示，该病例血清样本寨卡病毒核酸弱阳性、唾液样本寨卡病毒核酸阳性。RT-PCR扩增出预期大小约1.5Kb片段，测序结果表明该片段与巴西寨卡病毒株(GenBank号KX197250)相应序列的同源性为99%。系统进化树显示该病毒属亚洲谱系。结论 根据患者流行病学史、临床表现和病例标本核酸检测情况，确诊该病例为广东首例从苏里南地区输入性寨卡病例。

寨卡病毒；实时荧光RT-PCR；核酸检测；进化分析

寨卡病毒病是由寨卡病毒(Zika virus) 感染而引起的一类虫媒病毒病[1]，临床表现与登革热和基孔肯雅热类似，以发热、皮疹、关节痛和结膜炎常见，也可出现头痛、眼后痛、肌肉痛和呕吐症状[2]。2015年5月，巴西首次确认寨卡疫情本土传播后，疫情迅速蔓延扩散至南美洲多个国家，并出现了与之相关的数千例新生儿小头畸形和格林-巴利综合症等疑似病例[3]。截止2017年1月5日，全球75个国家和地区报告了蚊媒传播的寨卡疫情，29个国家报告与寨卡病毒有关的新生儿小头畸形和其他中枢神经系统畸形疫情，21个国家报告与寨卡病毒有关的格林-巴利综合症，疫情形势仍然严峻[4]。目前中国已报道有20余例输入性寨卡病毒感染病例。最新寨卡疫情亚洲和非洲风险报告称，若疫情持续爆发，位于亚洲地区的印度、中国和印尼恐怕将有更多人口暴露在寨卡风险之下[5]。近期，东南亚新加坡、越南等国暴发的寨卡疫情已经为之敲响了警钟[6-7]。因此，由于我国部分地区存在着寨卡病毒病流行的条件和传播媒介，与寨卡疫情流行区的人员往来频繁，如果不能在输入性疫情传播的初期进行有效控制，将导致疫情的大规模爆发，造成严重后果。

1 材料与方法

1.1 病例 陈某，女，40岁，旅苏里南籍华侨，2016年7月8日乘坐荷兰CZ308航班至广州白云国际机场，机场检验检疫局卫生检疫人员对其进行检疫查验和流行病学调查，得知该旅客一周前前往苏里南(寨卡病毒疫情发生国)，入境时申报头痛2 d，皮疹1 d。现场检疫查体发现全身散在皮疹，体温37.2 ℃。采集血液和唾液样本至广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心卫检室(以下简称卫检室)检测。同时送至定点医院进行对症治疗和防蚊等隔离治疗。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂和仪器 病毒RNA核酸提取试剂盒(QIAamp Viral RNA Kit)和一步RT-PCR扩增试剂(One step RT-PCR Kit)购自德国Qiagen公司，荧光PCR通用试剂(Ag-Path-IDTMOne step RT-PCR Kit)购自美国Ambion公司。商品化寨卡病毒核酸测定试剂盒(荧光RT-PCR法)购置上海之江生物科技股份有限公司，Stepone Plus、Q6荧光定量PCR仪和9700 PCR仪为美国ABI公司仪器。

1.2.2 核酸提取 按照病毒RNA核酸提取试剂盒说明书提取血清和唾液的病毒RNA，最后用60 μL洗脱液洗脱病毒核酸。-70 ℃冰箱保存。

1.2.3 引物和探针 在PrM基因高保守性区域设计引物和探针，用于实验室自主研制实时荧光RT-PCR法检测寨卡病毒核酸；在寨卡病毒保守区设计引物，用于寨卡病毒的RT-PCR扩增。引物和探针由上海生工合成，序列见表1。

表1 寨卡病毒核酸检测引物探针
Tab.1 Primers and probes of Zika virus

引物/探针名称PrimerandProbe序列(5-3')Alignment(5-3')扩增片段AmplifiedfragmentZIKVA1fGGATTTGGAAACGAGAGTTTCC-PrM-M-E基因,预期扩增片段1550bpZIKVA1rGAACCACTCCTTGTGAACCAZIKVupGTGACGCCACCATGAGCTATGAPrM基因,预计扩增片段115bpZIKVdpTGATGGCAGGTTCCGTACACAACZIKVProFAM-CCAAGTTGACGTCGTGTTGCACCAGCA-BHQ1

1.2.4 实时荧光RT-PCR 反应体系和条件 参照郑夔等寨卡病毒核酸实时荧光RT-PCR检测体系和条件进行[8]。商品化寨卡病毒核酸检测试剂盒按照说明书进行操作。

1.2.5 RT-PCR反应体系和条件 RT-PCR反应体系50 μL，包括无RNase水25.5 μL、10×RT-PCR缓冲液5 μL、2 mmol/L dNTPS 5 μL、25 mmol/L MgSO43 μL、酶0.5 μL、20 μmol/L ZIKVA1f 0.5 μL、20 μmol/L ZIKVA1r 0.5 μL、RNA 10 μL，同时设置阴、阳性对照。RT-PCR扩增反应程序为：60 ℃ 1 min；50 ℃ 30 min，95 ℃ 15 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min(35循环)；72 ℃ 5 min，4 ℃保存。最后取5 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。

1.2.6 序列分析与软件 用Lasergene软件包中EditSeq对序列进行整理并拼接。选取GenBank数据库中43株寨卡病毒的基因组相应序列下载作为参考序列，用MEGA5.0软件邻接法(Neighbour-Joining)构建系统进化树。

2 结 果

2.1 病例样本的实时荧光RT-PCR检测 使用实验室自研试剂和商品化检测试剂同时对病例血清和唾液样本进行寨卡病毒核酸实时荧光RT-PCR检测，两套检测试剂结果完全一致，病例的血清和唾液样本均有典型扩增曲线，其中唾液样本Ct值约为28～30，血清样本较弱，Ct值仅为38。

2.2 唾液样本RT-PCR扩增和序列测定 RT-PCR结果显示，唾液样本扩增出了预期大小1 550 bp片段。Blast比对表明该片段与巴西寨卡病毒株(GenBank号KX197250)相应序列的同源性有99%。

2.3 系统进化树构建 基于扩增的C-PrM-M-E基因序列构建了寨卡病毒系统进化树。系统进化树分成亚洲和非洲谱系，该病例寨卡病毒株(命名Surinam-3640A1)属亚洲谱系，与巴西寨卡病毒株(GenBank号KX197250和KY014697)、苏里南寨卡病毒株(GenBank号KU312312)等位于同一分支(图1)。

▲Surinam-3640A1表示该病例寨卡病毒▲Surinam-3640A1 represents Zika virus strain imported from Surinam case.图1 寨卡病毒C-PrM-M-E基因的系统进化分析Fig.1 Phylogenetic analysis based on C-PrM-M-E genes of Zika virus

2.4 广东省CDC复核和病例发布 7月10日，广东省CDC复核病例标本，结果为寨卡病毒核酸阳性。根据病例流行病学史、临床表现和病例标本核酸检测情况，广东省卫计委11日晚通报发布确诊该病例感染寨卡病毒，也是广东首例从苏里南输入的寨卡病毒病例。

3 讨 论

早在2015年11月，南美洲苏里南就向世界卫生组织通报了6例寨卡病毒感染本土病例[9-10]。2015 年 12 月 1 日，质检总局根据2014年以来寨卡病毒在巴西、哥伦比亚、苏里南等国本土区域流行以及新近上升态势，预警疫情存在跨境传播风险，发布《关于防止寨卡病毒感染疫情传入我国的公告》(2015年第141号)，寨卡病毒进入口岸卫生检疫视野[11]。截至2016年2月，荷兰本土共确诊了24例寨卡病毒感染输入性病例，这些病例均有苏里南或阿鲁巴旅行史[12]。这说明自2015年底苏里南已爆发寨卡病毒病疫情。截止2017年1月，广东省已有15例输入性寨卡病毒感染病例，其中13例来自委内瑞拉[8]，1例来自中美洲危地马拉，该病例是广东首例、也是仅有1例苏里南输入性寨卡病毒感染病例。

该病例入境时个人健康申报头痛2 d，皮疹1 d，实验室检测到唾液样本中寨卡病毒载量较高，血清样本寨卡病毒核酸检测为弱阳性，这表明该病例的病毒血症期快要结束，说明寨卡病毒在血清中持续时间较短，而可较长时间在尿液和唾液中检出，与文献报道报道结果一致[13-14]。提示若发现疑似病例时应第一时间进行实验室检测以明确诊断，并且除血清标本外应尽量同时采集唾液和尿液样本进行检测，有利于国境口岸无创伤性采样的要求。

苏里南属于南美洲，毗邻巴西北部，该病例C-PrM-M-E基因片段的测序结果表明其与巴西寨卡病毒株(GenBank号KX197250)相应序列同源性高达99%，系统进化树显示其与巴西病毒株(GenBank号KX197250和KY014697)、法属玻里尼西亚病毒株(GenBank号KX447513和KX447519)等位于亚洲谱系的同一进化分支，推测引起苏里南疫情暴发的寨卡病毒与南美洲和太平洋岛国疫源地的毒株相同。

建议有意向前往寨卡疫区的人员提前应到当地检验检疫机构了解目的地疫情情况，提高自我防护意识并做好个人防护，并特别提醒孕期妇女尽量避免前往寨卡病毒流行国家或地区[8]。目前我国正处于冬春交替之季，随着入春后气温逐步回升，蚊虫开始滋生，广东等南方地区应尽早做好防控准备[15]。

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Laboratory diagnosis of the first imported case of Zika virus infection from Suriname into Guangdong，China

LIANG Jie-yi1, DAI Jun1, LI Dong-hong1, SHI Yong-xia1, HUANG Ji-cheng1,YUAN Shuai1, ZHENG Kui1, LI Xiao-bo1, ZHANG Xian-guang2, SONG Wei2, WU Hui-ming2

(1.InspectionandQuarantineTechnicalCenter,GuangdongEntry-exitInspectionandQuarantineBureau,Guangzhou510700,China;2.GuangdongEntry-exitInspectionandQuarantineBureau,Guangzhou510623,China)

We detected Zika virus (ZIKV) in a febrile case returning from Suriname and entry China from Guangzhou Baiyun International Airport Port. Serum and saliva samples were collected from a suspected case returning from Suriname. We detected ZIKV RNA using real-time fluorescence RT-PCR methods by both in-house reagent and commercial detection kits. RT-PCR detection was carried out with saliva sample and sequence analysis was performed. Phylogenetic tree was constructed to analyze the source of imported cases. Real-time fluorescent RT-PCR result showed that saliva was detected ZIKV RNA positive while for serum was weakly positive. A specific 1 500 bp fragment in size was amplified with saliva sample by RT-PCR. Sequence analysis showed 99% homologous to the corresponding sequence of Brazil ZIKV (GenBank No. KX197250). Phylogenetic tree indicated it was located on African lineage. According to the epidemiological investigation results, clinical manifestations and nucleic acid detection of case, the suspected case was confirmed to infect Zika virus, being the first case from Suriname into Guangdong Province.

Zika virus; real-time fluorescent RT-PCR; nucleic acid detection; phylogenetic analysis

Shi Yong-xia, Email: 93240850@qq.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.06.010

师永霞，Email: 93240850@qq.com

1.广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心卫生检疫实验室,广州 510700； 2.广东出入境检验检疫局,广州 510623

R373.1

A

1002-2694(2017)06-0523-04

2017-02-27 编辑：李友松

广东省科技计划项目(No.2016A020247001)和广东检验检疫局科技计划项目(No.2016GDK58)联合资助

Supported by the Science and Technology Planning Project of Guangdong province (Grant No. 2016A020247001), and the Science and Technology Planning Project of Guangdong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau(No.2016GDK58)