胡挺松，张海林，刘永华，徐松淼，李华昌，邓 波，尹小雄，黄 瑛，张富强，范泉水



云南中缅边境登革1型病毒全基因组序列特征研究

胡挺松1，张海林1，刘永华2，徐松淼1，李华昌3，邓 波1，尹小雄2，黄 瑛4，张富强1，范泉水1

目的 阐明云南省中缅边境地区2013-2015年14株登革1型病毒(DENV-1)全基因组序列特征。方法 采用C6/36 细胞培养法分离病毒，用RT-PCR法扩增新分离DENV-1的全基因组序列，采用ClastalX1.83和MEGA6等生物信息学软件进行核苷酸和推导氨基酸序列同源性及系统进化分析。结果 从登革热患者血清中分离到14株DENV-1，其中瑞丽市9株，临沧市3株，昆明市2株。经RT-PCR和序列测定，获得这14株DENV-1的全基因组序列(10 735nt)，其开放读码框(95-10 271)编码 3 392个氨基酸。系统进化和同源性分析表明，13株为基因I型(G-I)，其中瑞丽和临沧本地病例7株，缅甸输入性病例6株；1株为G-III(昆明的印度输入性病例)。云南13株G-I可分为2个进化群，但均与缅甸、泰国等东南亚流行株具有较近的亲缘关系。云南13株G-I的E基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为97.02%-100%和98.78%-100%，它们与6株东南亚G-I参考株的核苷酸和氨基酸同源性分别为96.53%-99.53%和97.33%-100%，与DENV-1原型株US_Hawaii核苷酸和氨基酸同源性分别为93.76%-94.45%和95.86%-96.91%。所有云南株和东南亚参考株与US_Hawaii株在结构蛋白或非结构蛋白的氨基酸位点分别存在44和150个位点差异。结论 云南中缅边境地区2013-2015年流行的DENV-1均为G-I，并具有基因多样性特点但均为来自缅甸的多个传播来源。

登革1型病毒；全基因组；系统进化分析；同源性分析；氨基酸位点分析

登革热(dengue fever, DF)是由登革病毒(dengue virus, DENV)引起经伊蚊传播的一种急性传染病，DENV分为1、2、3和4血清型(serotype)。DENV为有包膜的单股、正链RNA 病毒，基因组全长约10～11kb，编码3种结构蛋白(C、PrM/M 和E)和7种非结构蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b 和NS5)。近10多年来，全球DF流行显著增强，地理范围不断扩大，疾病负担逐渐加重，成为重要的公共卫生问题[1-3]。本病在东南亚地区流行较为严重，近几年我国广东、福建、广西等东南沿海地区常有流行[4-6]。云南省位于中国西南边境地区，与越南、老挝和缅甸接壤并设有较多的边境口岸和通道，境内外人员和物资交流频繁，DF可通过输入性病例或带病毒的媒介伊蚊将病毒传播到云南省。近10多年来，云南省每年均有来自境外的DF输入性病例[7-8]。2013-2015年云南省西南边境地区发生本地DF流行，其中中缅边境地区的德宏州瑞丽市和临沧市发生了由登革1型病毒(DENV-1)引起的本地DF暴发疫情[9-11]。

近几年的研究发现，DENV基因多样性在不断增加，导致产生大量不同毒力的病毒株，这意味着人类将受到更多类型的致病性DENV的攻击。因此，对各地不同时期DENV流行株的全基因组序列测定和分析，不仅可掌握DENV遗传进化特点，并可对自然界中DENV的基因变异起到监测作用。此前，我们曾对DENV-1引起的疫情进行了流行病学调查和病毒部分基因序列测定及血清型鉴定[9-11]，但缺乏对病原体的深入研究。本研究从云南DF患者中分离到14株DENV-1，并对它们进行全基因组序列测定和分析，以期阐明该地区DENV-1流行株的遗传进化和流行病学特点，为本病预防控制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 患者标本 2013-2015年在云南省德宏州、临沧市和昆明市采集登革热患者急性期血清标本，并按文献方法[2]进行DENV核酸检测和血清型鉴定，获得的DENV-1感染的患者血清标本。

1.2 病毒分离 用C6/36 细胞(军事医学科学院五所提供)培养法分离病毒。取DENV-1阳性患者血清100 μL，用细胞培养液1∶10稀释，接种于已长成单层的C6/36细胞，置4% CO2恒温培养箱28 ℃培养。每日于倒置显微镜下观察细胞病变(CPE)，待75% 以上细胞出现病变，收取细胞上清液，低温保存备用。

1.3 RT-PCR和序列测定 用Axygen 公司的AxyPrep Body Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit 提取病毒分离物中的病毒RNA，用美国Invitrogen公司的SuperScript○RIII One-Step RT-PCR System with Platinum○RTaq Kit 试剂盒一步法RT-PCR扩增DENV全基因序列，将上述PCR产物进行1% 琼脂糖凝胶电泳并割胶回收，直接测序。引物自行设计，根据GenBank中的DENV-1基因序列，利用MEGA6软件进行比对，找出相对保守区域，利用Primer Premier软件设计DENV-1全基因序列的引物：DEV1-1F: 5′ AGT TGT TAG TCT ACG TGG ACCG 3′, DEV1-2136R: 5′ ATT TTC CCT ATG CTG CTT CC 3′; DEV1-1883F: 5′ CAT GGA ACC GTT CTA GTG CAG 3′, DEV1-4234R: 5′ TCC AGC TAT TAG TGG CCC AG 3′; DEV1-3818F: 5′ GAG TTA CCA AAT TCC TTG GAG G 3′，DEV1-6218R: 5′ CGT CAA AGC ACC ATC TTC TG 3′; DEV1-5907F: 5′ GAA GGA ACC ACA ATA AGG AAGG 3′, DEV1-8144R: 5′ CCA CCA CAC TTG GCA TGT AG 3′; DEV1-7725F: 5′ CCA AAC ATG CAG TGT CGA GAG 3′, DEV1-9397R:5′ TAA GCC ATA GGT TCCA ACC TG 3′; DEV1-9071F: 5′ GAG AAT TCA CTC AGC GGA GTG 3′，DEV1-10735R: 5′ AGA ACC TGT TGA TTC AAC AGCA 3′。引物合成和扩增产物测序均由昆明硕挚生物科技有限公司完成。

1.4 序列分析 采用ClastalX1.83进行核苷酸序列比对，采用MEGA6软件邻接法(neighbor-joining)进行DENV基因核苷酸序列系统发生树分析[13]。同源性和系统进化分析均引用GenBank中16株DENV-1，其中7株为基因I型(G-I)：包括DENV-1原型株即国际参考株US_Hawaii(KM204119，美国夏威夷，1944)以及Myanmar.37726 (AY726549，缅甸)、Myanmar.44168 (AY 726551，缅甸)、TH/BID-V2270/2001 (FJ687427，泰国)、SL_2009c (HQ891315斯里兰卡)、GZ_OY(FJ176779，广东，2006)和VN_BID-V2836/2004(FJ882569，越南)；2株G-II：hu/Seychelles/NIID41 (AB195673，塞舌尔输入到日本)和Reunion 185(DQ285558，留尼旺岛，2004)；3株G-III：NI/BID-V1223/2007(FJ898433，尼加拉瓜)、NI BID/V621/2005(FJ410290，尼加拉瓜)和RR107(KF289072，印度)；2株G-IV：PF08/070308-138(JQ915073，法属波利尼西亚)和PF07/230407-201(JQ915071，法属波利尼西亚)；2株G-V：HawO3663(DQ672564，美国)和DS212-110306(EU179861，文莱)。其中的US_Hawaii株，除与其它参考株一并用于核苷酸和氨基酸同源性及进化分析外，作为氨基酸位点差异比对分析所参照的标准株[12]。

2 结 果

2.1 病毒分离 从DF患者急性期血清中共分离到14株DENV-1，其中7株分离自本地感染病例，另外7株分离自境外输入性病例(表1)。年度分布为2013年2株、2014年6株、2015年6株。地区分布为德宏州瑞丽市9株、临沧市3株、昆明市2株。

表1 云南省14株登革1型病毒的背景信息
Tab.1 Background information of 14 strains of DENV-1 isolated from Yunnan Province, China

毒株名称Virusstrain基因库号GenBankno.基因型Genotype年份Year城市City病例性质TypeofcaseYNH12KY672943G-I2013昆明市Kunming缅甸输入病例ImportedcasefromMyanmarYNH22KY672944G-III2013昆明市Kunming印度输入病例ImportedcasefromIndiaDGRL-6KY672937G-I2014瑞丽市Ruili本地感染病例IndigenouscaseDGRL-32KY672938G-I2014瑞丽市Ruili本地感染病例IndigenouscaseDGRL-49KY672939G-I2014瑞丽市Ruili本地感染病例IndigenouscaseDGRL-157KY672940G-I2014瑞丽市Ruili缅甸输入病例ImportedcasefromMyanmarDGRL-161KY672941G-I2014瑞丽市Ruili缅甸输入病例ImportedcasefromMyanmarDGRL-177KY672942G-I2014瑞丽市Ruili本地感染病例Indigenouscase15DGR7KY672932G-I2015瑞丽市Ruili本地感染病例Indigenouscase15DGR4KY672931G-I2015瑞丽市Ruili缅甸输入病例ImportedcasefromMyanmar15DGR55KY672933G-I2015瑞丽市Ruili缅甸输入病例ImportedcasefromMyanmarLC1502KY672936G-I2015临沧市Lincang本地感染病例IndigenouscaseGM1503KY672935G-I2015临沧市Lincang本地感染病例IndigenouscaseGM1502KY672934G-I2015临沧市Lincang缅甸输入病例ImportedcasefromMyanmar

2.2 序列测定 经全基因组序列测定，获得上述14株云南DENV-1的全基因核苷酸序列，全长约为10 735nt，其开放读码框(95-10 271)编码 3 392 个氨基酸前体蛋白，依次包含3个结构蛋白(C、prM/M、E)和7个非结构蛋白蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5)。所有这14株DENV-1的全基因核苷酸序列均已提交到GenBank。

2.2 进化分析 云南14株DENV-1与来自GenBank中16株不同基因型DENV-1参考株的核苷酸序列构建系统进化树，图1和2显示，云南新分离株间无论在全基因(Complete genome)还是C/prM/M、E、NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5基因核苷酸序列均存在一定差异，并可分为两个基因型，其中13株为G-I，1株为G-III。所有瑞丽(2014和2015年)和临沧(2015年)本地病例和输入性病例的分离株均为G-I，但它们间仍然存在一定差异。根据E、NS1和NS5等基因序列进化分析，云南G-I流行株至少可分为2个进化亚支，其中2014年瑞丽流行株(DGRL-6、DGRL-32、DGRL-49和DGRL-157)高度聚集为一个亚支并与瑞丽2015年15DGR55株以及缅甸流行株(Myanmar_37726和Myanmar_44168)亲缘关系较近，同为一个进化支；瑞丽2015年15DGR7和15DGR4株与2014年DGRL-161和DGRL-177株以及临沧流行株(LC1502、GM1503和GM1502)虽同在一个亚支，但它们间仍存在着一定差异，但均与泰国TH/BID-V2270株、斯里兰卡SL_2009c株和广州株(GZ_OY)具有较近的亲缘关系。图1和2还显示，包括云南株及东南亚参考株在内的所有G-I株均与原型株US_Hawaii株进化关系稍远。另外，2013年昆明市2株DENV-1分别为G-I(YNH12)和G-III(YNH22)，其中YNH12株分离自来自缅甸的输入病例，与2015年临沧流行株具有较近的进化关系；YNH22株则分离自来自印度的输入性病例，与印度2011年流行株(RR107)具有较近的亲缘关系(图1和2)。此外，本次云南株非编码区3′UTR的进化分析结果与编码区分析基本相似。

2.3 核苷酸和氨基酸同源性分析 云南14株DENV-1与16株DENV-1参考株的E基因进行核苷酸和推导氨基酸序列同源性分析。所有云南株DENV-1间的核苷酸和氨基酸同源性分别为89.85%-100.0%和96.91%-100.0%，其中以G-III(YNH22)与G-I(13株)间核苷酸(89.85%-90.82%)和氨基酸(96.91%-97.54%)同源性差异较大，而13株G-I间的核苷酸(97.02%-100%)和氨基酸(98.78%-100%)同源性仅存在较小差异。云南13株G-I与7株G-I参考株间的核苷酸和氨基酸同源性分别为93.76%-99.46%和95.86%-100%，其中，与DENV-1原型株US_ Hawaii核苷酸和氨基酸同源性分别为93.76%-94.45%和95.86% -96.91%，差异较大；而与其它6株东南亚流行株核苷酸和氨基酸同源性分别为96.53%-99.53%和97.33% -100%，同源性较高。进一步分析发现，瑞丽2014年流行株(DGRL-6、DGRL-32、DGRL-49、DGRL-157)和2015年15DGR55株(输入病例)与缅甸流行株(Myanmar_3772和Myanmar_44168)间核苷酸(98.43%-99.18%)和氨基酸(98.78%-99.80%)同源性最高；2015年瑞丽流行株(15DGR4和15DGR7)、临沧流行株(LC1502、GM1503、GM1502)和昆明YNH12株与广州GZ_OY株的核苷酸同源性为98.98%-99.53%，氨基酸同源性均为100%；而2014年瑞丽DGRL-161和DGRL-177 株则与泰国TH/BID-V2270株和斯里兰卡SL_2009c株的核苷酸(98.76%-99.46%)和氨基酸(99.19%-99.80%)同源性最高。

注：黑色圆形代表分离自云南省的DENV-1Black circles represent the strains isolated from Yunnan Province, China.图1 云南省14株DENV-1 全基因(complete genome)、C/PrM/M和E基因序列进化分析Fig.1 Phylogenetic tree based on the complete genome, C/PrM/M and E genes of 14 DENV-1 strains isolated from Yunnan Province, China

注：黑色圆形代表分离自云南省的DENV-1Black circles represent the strains isolated from Yunnan Province, China图2 云南省14株DENV-1 NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5 and 3′UTR基因序列进化分析Fig.2 Phylogenetic tree based on the NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, NS5 and 3′UTR genes of 14 DENV-1 strains isolated from Yunnan Province, China

云南13株G-I与G-II、G-III、G-IV和GV间的核苷酸(氨基酸)同源性分别为89.99%-90.94%(96.49%-97.33%)、89.90%-90.44%(95.87%-96.92%)、89.85%-90.89%(96.28%-99.80%)和89.36%-91.31%(96.07%-97.12%)，它们间存在明显差异。

云南G-III株(YNH22)与3株G-III参考株间的核苷酸(氨基酸)同源性分别为94.12%-99.59%(98.78%-99.53%)，与G-I、G-II、G-IV和G-V参考株间的核苷酸(氨基酸)同源性分别为90.41%-91.06%(97.33%-97.75%)、89.55%-89.63%(97.33%)、89.47%-89.79%(97.13%-97.54%)、90.80%-91.83%(97.13%)。

2.4 氨基酸位点分析 云南14株DENV-1与上述参考株进行氨基酸位点的差异分析，并以原型株US_Hawaii株作为参照进行氨基酸位点比对。表2显示，无论结构蛋白(C、prM/M、E)或非结构蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5)的氨基酸序列均存在差异。云南株C、PrM/M、E蛋白分别有5、12和27个氨基酸位点的改变，如瑞丽2014年的DGRL-6、DGRL-32、DGRL-49、DGRL-157以及缅甸的Myanmar_37726和Myanmar_44168株在PrM/M-73位点均有改变(T-S)；除上述瑞丽2014年4株和2015年的15DGR55株外，其它G-I云南株均在PrM/M-122位点有改变(K-R)。云南13株G-I和G-I参考株均在E-8(N-S)、E-155(T-S)、E-171(S-T)、E-324(V-I)、E-461(I-V)等位点发生改变；除上述瑞丽2014年4株和15DGR55株外，其它云南株均存在E-114(I-L)位点改变。部分云南株还检测到包括E-52(K-N)、E-55(V-I)、E-203(E-G)、E-227(P-S)、 E-234(E-Q)、E-270(I-F) 、E-277(K-T) 、E-278(I-N)、E-337(F-I)、E-369(A-T)、E-380(V-I)、E-382(A-V)位点改变。此外，表2显示的氨基酸种类均为与原型株US_Hawaii株存在有差异的氨基酸位点，而空白位置则为未发生改变的氨基酸位点。

表2 DENV-1云南株与US_ Hawaii株E蛋白氨基酸差异位点比较
Tab.2 Different sites of amino acid in E sequences in Yunnan strains and US_ Hawaii strain of DENV-1

位点Site12345678910111213141516171819202122232425262728E-8NSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSE-37DNNNNE-52KNNNNNNNNNSNNNNNNNNNNNNNNNNNE-55VVVVVVVVVVIIE-114ILLLLLLLLLLLLLLLE-155TSSSSSSSSSSSSSSSSSSSE-161ITTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTE-171STTTTTTTTTTTTTTTTTTE-203EGGGGE-227PSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSSE-234EQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQE-270IFE-277KTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTE-278INE-290NDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDE-291KQE-324VIIIIIIIIIIIIIIIIIIIE-337FIIE-369ATTTTE-380VIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIE-382AVVVVVVE-402LFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFE-429FLLE-439IVVVVE-461IVVVVVVVVVVVVVVVVVVVVE-473ATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTE-484MLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLL

注Note：阿拉伯数字表示本研究中的病毒株名称。Arabic numeral represent the virus strain names in the study: 1：US_ Hawaii；2：SL_ 2009c；3：TH_BID-V2270；4：Myanmar_44168；5：Myanmar_37726；6：GZ_OY；7：VN_BID-V2836；8：Reunion 185；9：RR 107；10：NI_BID-V1223；11：NI_BID-V621；12：hu_Seychelles_NIID41；13：HawO3663；14：DS212-110306；15：YNH22；16：YNH12；17：LC1502；18：GM1503；19：GM1502；20：DGRL-177；21：DGRL-161；22：DGRL-157；23：DGRL-49；24：DGRL-32；25：DGRL-6；26：15 DGR55；27：15 DGR7；28：15 DGR4.

云南株NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5蛋白依次存在24、16、6、34、7、16、47个氨基酸的改变。从NS1看，上述瑞丽2014年4株和15DGR55株在NS1-111(H-Y)位点均有改变；在NS1-131位点，除前述这5株发生T-A改变外，其它G-I云南分离株均发生K-S改变；在NS1-144位点，除前述这5株外，其它G-I分离株均发生P-S改变。此外，2014年瑞丽DGRL-6、DGRL-32、DGRL-49和DGRL-157株在NS2a-34(T-A)、NS2b-85(K-R)、NS4a-72(F-L)、NS5-59(I-A)、NS5-253(R-K)、NS5-642(V-A)、NS5-785(D-N)、NS5-687(V-I)等位点均存在改变。2015年临沧分离株(LC1502、GM1503和 GM1502)在NS2a-114(V-M)、NS2a-178(F-L)、NS3-77(I-L)、NS3-258(V-I)和NS5-30(R-K)等位点圴有改变。所有云南13株G-I在NS2b-112(I-L)、NS3-26(L-M)、NS3-44(G-N)、NS3-85(F-L)、NS3-293(A-S)、NS3-350(D-E)、NS3-466(Q-H)、NS4a-39(K-R)、NS5-135(T-I)、NS5-285(N-H)、NS5-325(R-K)、NS5-649(H-Y)等位点均发生了改变。

3 讨 论

四种血清型DENV广泛流行于全球热带和亚热带地区，其中尤以DENV-I流行较为广泛[13-17]。DENV最早分离于20世纪40年代，首次分离到DENV-1(US Hawaii株，1944年夏威夷)至今已70多年。研究认为，不同地区的DENV-1存在一定差异并具明显地域特征，该血清型可分为5个基因型，其中G-I为主要基因型，亦属东南亚DENV-1的优势基因型[13-17]。当前，G-I仍在全球传播扩散，如2014年日本东京[19]以及我国广东[4]、福建[5]、广西[7]等地DF暴发的病原均为该基因型。本次对云南省DENV-1全编码区包括结构蛋白和非结构蛋白基因核苷酸进化分析表明，2014和2015年瑞丽及2015年临沧发生的本地DF暴发疫情的病原均为G-I，但这些G-I病毒间仍然存在一定差异，可分为不同的进化群。如对瑞丽连续两年G-I流行株的比较发现，无论2014或2015年瑞丽均存在上述两个进化群病毒的流行，提示这两年虽有不同传播来源的流行株，但当地仍可能存在跨年传播的病毒株。而2015年临沧流行株则与同年瑞丽流行株具有较近的亲缘关系，但与2014年瑞丽流行株存在明显差异，提示2015年临沧和瑞丽流行株可能来自同一进化群。

上述每起DENV-1疫情中，本次均从缅甸输入性病例和本地病例中分离到DENV-1的G-I病毒，这两类病例所感染的病毒株均具较近亲缘性和较高同源性。如2014年瑞丽本地病例病毒株(DGRL-6、DGRL-32、DGRL-49)和缅甸输入性病例病毒株(DGRL-157)均属同一进化亚群；2015年瑞丽市本地病例病毒株(15DGR7)和输入性病例病毒株(15DGR4)亦为同一亚群；2015年临沧市本地病例病毒株(LC1502、GM1503)和缅甸输入病例病毒株(GM1502)也属相同亚群。由此认为，来自相邻缅甸边境地区的DF输入性病例是引起瑞丽和临沧市本地DENV-1流行的主要原因，DENV-1的G-I进化群属滇西南中缅两侧边境地区DF流行的主要病原。此外，本次从昆明市输入性DF患者血清中分离到的两株DENV-1分别为G-I和G-III，前者与瑞丽和临沧市流行株具有较近的亲缘性，后者为分离自印度输入性病例并与近期印度流行株具有较近的亲缘关系，尚未发现G-III本地流行。

E蛋白存在于DENV粒子表面，为主要病毒抗原，它可通过诱发中和抗体产生保护性免疫反应，阻断病毒与细胞的融合，DENV的毒力基因大多在E 区。目前认为E 蛋白中影响DENV毒力的3 个区段是：III区(残基303～395)，如突变会影响病毒的细胞嗜性和侵入细胞；II区(52～136 和190～284)，若改变会影响病毒促融合活性；II区和III区分界面之间的区域(294～305)[19-20]。本研究云南DENV-1分离株在E 蛋白III区和II区中发现27个氨基酸位点改变，这些位点的改变是否会引起病毒细胞嗜性和毒力等改变尚需进一步研究。E 蛋白中的E155(156)作为糖基化位点，如被破坏会影响病毒毒力，已在DENV-1和DENV-4得到证实，本次发现云南株中E155位点已发生改变(T-S)。E390位点的改变可能会引起E 蛋白功能区中III区的特异性表位的改变，进而增强病毒对宿主细胞的吸附而加重感染并可能与DHF/DSS的发生有关[20]，本次未从云南分离株中检测到E390位点的改变。DENV非结构蛋白主要参与病毒的复制，有的与抗原性和毒力也有一定关系。本次云南株中几乎每一种非结构蛋白均存在一定程度的改变，其中与抗原性相关的NS1也有较多位点改变。另外NS3 具有丝氨酸蛋白酶活性及核苷三磷酸酶活性(NTPase) /RNA解旋酶活性，NS3与此相关的位点在160～180区位，本次仅发现云南有1株(15DGR55)的NS3-170发生(A-T)改变。

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Molecular characteristics of the full-length genome of dengue serotype 1 virus strains isolated from dengue fever cases in Sino-Myanmar border region in Yunnan Province, China

HU Ting-song1, ZHANG Hai-lin1, LIU Yong-hua2, XU Song-miao1, YIN Xiao-xiong2, LI Hua-chang3, DENG Bo1, HUANG Ying4, ZHANG Fu-qiang1, FAN Quan-shui1

(1.CenterforDiseaseControlandPrevention,ChengduMilitaryRegion,Kunming650118,China;2.RuiliCenterforDiseaseControlandPrevention,Ruili678600,China;3.LincangPrefectureCenterforDiseaseControlandPrevention,Lincang677000,China;4.TheThirdPeople’sHospitalofKunming,Kunming650041,China)

We investigated the molecular characteristics of the full-length genome of 14 dengue serotype 1 virus (DENV-1) strains isolated in Sino-Myanmar border region in Yunnan Province, China during 2013-2015. Isolation of dengue virus was using C6/36 cell culture method. Viral RNA was extracted from virus isolates, and then the full-length genome was amplified by RT-PCR. The homology and phylogenetic analysis was made on the nucleotide and deduced amino acid sequences by bioinformatics software including ClastalX1.83 and MEGA6 etc. Results showed that fourteen strains of DENV-1 isolated from dengue fever cases, of these, 9 strains from Ruili City of Dehong Prefecture, 3 from Lincang Prefecture, 2 from Kunming City. RT-PCR and sequencing indicated that the full-length genes (10 735 nt) of 14 DENV-1 strains were obtained, and their open reading frame (95-10 271) were coded 3 392 amino acid residues. The genotypes of DENV-1 were revealed by homology and phylogenetic analysis based on structural and non-structural proteins. Thirteen were genotype I (G-I) (7 from indigenous cases in Ruili and Lincang and 6 from imported case from Myanmar to Ruili, Lincang and Kunming), and 1 G-III from imported case from India to Kunming. The phylogenic analysis indicated that the 13 isolates from Yunnan divided into 2 phylogenic subgroups, and they had a closer genetic relationship with the strains isolated from Southeast Asia. The gene sequences of the 13 G-I strains have been acquired, the rate of their nucleotide homology and amino acid homology were 97.02%-100% and 98.78%-100% respectively. Compared with 6 strains from Southeast Asia,nucleotide homology and amino acid homology were 96.53%-99.53% and 97.33%-100% respectively. Compared with prototype strain (US_Hawaii) of DENV-1，nucleotide homology and amino acid homology were 93.76%-94.45% and 95.86%-96.91% respectively.Compared with US_Hawaii strain, there were 44 and 150 different sites in amino acid of structural and non-structural proteins, respectively. The G-1 of DENV-1 have been popular in Sino-Myanmar border region in Yunnan, 2013-2015. They have genetic diversity but multiple transmission sources were from Myanmar, and should strengthen control cross-border spread of dengue fever in this region. It is necessary to further study that change of the amino acid sites of Yunnan strains of DENV-1 is related to its antigenicity and pathogenicity.

dengue serotype 1 virus; full-length genome; phylogenetic analysis; homology analysis; amino acid site analysis

s: Zhang Fu-qiang, Email: zfq1968@aliyun.com;Fan Quan-shui, Email: fqs168@126.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.06.001

国家十三、五重大专项(No.2016YFC1200100)，全军青年培育项目(15QNP035)和中国博士后基金 (No.2015M582907、2016T91009)联合资助

张富强，Email: zfq1968@aliyun.com 范泉水，Email: fqs168@126.com

1.成都军区疾病预防控制中心，昆明 650118； 2.瑞丽市疾病预防控制中心，瑞丽 678600； 3.临沧市疾病预防控制中心，临沧 677000； 4.昆明市第三人民医院，昆明 650041

R373.3

A

1002-2694(2017)06-0473-08

2017-02-21 编辑：李友松

Supported by the National Key Basic Research Program of China (No. 2016YFC1200100), the Science and Technology Programs of Military (No. 15QNP035), and the General Financial Grant from the China Postdoctoral Science Foundation (Nos. 2015M582907 and 2016T91009)