俞开敏，杨兰，陆俊佳

(1广西壮族自治区人民医院，南宁530021；2南宁市第二人民医院)

血清Cys C及其+73、-82位点基因多态性与广西壮族人群代谢综合征发病的关系

俞开敏1，杨兰2，陆俊佳2

(1广西壮族自治区人民医院，南宁530021；2南宁市第二人民医院)

目的 探讨血清胱抑素C(Cys C)及其+73和-82位点基因多态性与广西壮族人群代谢综合征(MS)发病的关系。方法 选择壮族MS患者和汉族MS患者各100例(分别为壮族MS组和汉族MS组)，同期体检健康的壮族和汉族志愿者各100例(分别为壮族健康组和汉族健康组)。采用免疫比浊法检测各组血清Cys C、肌酐(Cr)，聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法检测Cys C+73、-82位点基因多态性。结果 血清Cys C、Cr水平：壮族MS组均高于壮族健康组，汉族MS组均高于汉族健康组(P均<0.01)；壮族MS组与汉族MS组比较、壮族健康组与汉族健康组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。血清Cys C与Cr水平呈正相关(r=0.634，P<0.01)。四组Cys C +73、-82位点等位基因频率两两比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。结论 广西壮族MS患者血清Cys C水平升高，可反映患者的肾功能状态；Cys C +73、-82位点基因多态性可能与MS的发病及民族情况均无关。

代谢综合征；胱抑素C；基因多态性；肾功能；壮族；广西地区

代谢综合征(MS)是一组多种代谢异常聚集的病理状态和临床症侯群，MS患者多伴有高血压、血脂升高、糖耐量降低以及肥胖，是心血管疾病的主要危险因素。胱抑素C(Cys C)是反映肾小球滤过功能的内源性标志物，可调节特异性组织蛋白酶的活性，影响细胞外基质产生、降解的动态平衡以及粒细胞的吞噬、趋化作用，也与心血管疾病的发生密切相关，其基因突变位点及其频率分布受人种、地域等因素的影响较大。本研究探讨广西壮族MS发病与患者血清Cys C及其+73、-82位点基因多态性的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2013年6月～2015年1月广西壮族自治区人民医院收治的壮族MS患者和汉族MS患者各100例(分别为壮族MS组和汉族MS组)，同期体检健康的壮族和汉族志愿者各100例(分别为壮族健康组和汉族健康组)。MS的诊断标准参照《中国成人血脂异常防治指南》[3]。壮族MS组及壮族健康组要求至少三代以上未与外族通婚，各组均无遗传性疾病家族史及其他急慢性病史，各组间均无血缘关系。壮族MS组男52例、女48例，年龄46～75岁、中位年龄53.1岁；壮族健康组男55例、女45例，年龄50～71岁、中位年龄53.9岁；汉族MS组男55例、女45例，年龄47～78岁、中位年龄54.3岁；汉族健康组男53例、女47例，年龄49～72岁、中位年龄54.4岁。各组性别、年龄均具有可比性。本研究获得医院伦理委员会审核，受试者均知情同意。

1.2 血清Cys C和肌酐(Cr)水平检测 抽取各组空腹静脉血3 mL，注入干燥管中。静置30 min后，低速(3 000 r/min)离心10 min，分离血清后-20 ℃冰箱保存。应用日立7600全自动生化仪，采用免疫比浊法检测血清Cys C和Cr。

1.3 Cys C +73、-82位点基因多态性检测 采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法。取各组空腹静脉血2 mL于EDTA抗凝管，充分混匀，严格按照DNA抽提试剂盒(北京天根生化科技有限公司)说明书操作制备全血DNA，-20 ℃保存备用。根据GenBank提供的Cys C基因启动子序列，采用Primer5.0软件设计引物：Cys C +73上游引物：5′-TCTATCTAGCTCCAGCCTCTCG-3′，下游引物：5′-TGCTGGCTTTGTTGTACTCG-3′，引物长度254 bp；Cys C-82上游引物：5′-GATGGATGGGGAAGGACAG-3′，下游引物：5′-CAGGATGGCCAGCAGGAG-3′，引物长度379 bp。PCR反应体系共50 μL：PCR混合反应液8 μL(含dNTP、buffer)、Taq酶 0.5 μL、无菌水37.5 μL、DNA模版2 μL，上、下游引物各1 μL。扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，62 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共35个循环；72 ℃延伸5 min。进行基因位点限制性片段长度多态性分析：①Cys C +73位点：PCR后产物20 μL、NgoMⅣ内切酶1 μL，buffer 3 μL，无菌水6 μL，37 ℃酶切1 h。PCR产物长度为254 bp(A等位基因)，酶切后为63和191 bp的两个片段(G等位基因)。②Cys C-82位点：PCR后产物20 μL、SacⅡ内切酶1 μL，buffer 3 μL，无菌水6 μL，37 ℃酶切1 h。PCR产物长度为379 bp(C等位基因) ，酶切后为179和200 bp的两个片段(G等位基因)。将5 μL酶切后产物在2%琼脂糖凝胶上点样，电压100 V，电泳30 min后凝胶图象分析仪下观察电泳结果并摄像保存，记录Cys C +73、-82位点基因型，并计算等位基因频率。

2 结果

2.1 四组血清Cys C、Cr水平比较 血清Cys C、Cr水平：壮族MS组均高于壮族健康组，汉族MS组均高于汉族健康组(P均<0.01)；壮族MS组与汉族MS组比较、壮族健康组与汉族健康组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；见表1。直线相关性分析结果显示，血清Cys C与Cr水平呈正相关(r=0.634，P<0.01)。

表1 四组血清Cys C、Cr水平比较

注：与壮族健康组比较，*P<0.01；与汉族健康组比较，#P<0.01。

2.2 四组Cys C +73、-82位点基因型及等位基因频率比较 Hardy-Weinberg平衡检验结果显示，Cys C +73、-82位点基因分布符合群体遗传平衡法则，具有群体代表性(P均>0.05)。四组Cys C +73、-82位点等位基因频率比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 四组Cys C +73、-82位点基因型及等位基因频率

3 讨论

MS是环境因素、多基因遗传因素和不良生活习惯综合作用而引起的综合征[1]， 其引发的多种代谢异常均为心血管疾病的重要危险因素。Cys C表达于所有有核细胞，参与机体许多生理和病理过程，除了作为评价肾小球滤过功能的一个重要指标外[2]，还可与组织蛋白酶等胱抑素酶形成紧密复合物，从而抑制组织蛋白酶的活性，影响细胞外基质产生和降解的动态平衡，以及粒细胞的吞噬及趋化作用，参与AS和炎症反应的病理过程[3，4]。Cys C是心血管事件的一个独立预测因子，也是心血管事件发生及死亡的潜在预测因子[5～7]。因此推测Cys C可能与MS有关。本研究结果显示，壮族MS组血清Cys C及Cr水平均明显高于壮族健康组，汉族MS组均明显高于汉族健康组，与以往研究[8，9]结果相似。直线相关性分析显示，血清Cys C与Cr水平呈正相关，进一步证明Cys C是评价肾滤过功能的一项可靠指标。但本研究部分研究对象临床信息不全，不能进一步分层，故血清Cys C水平能否作为MS患者发生心血管事件的预测因子仍需进一步完善。

Cys C编码基因位于染色体20p11.2，是cystatin超家族的成员之一[10]。有前瞻性队列研究发现，Cys C基因突变可能引起其合成和分泌降低，使Cys C酶的抑制功能减弱，导致机体发生一系列生理、病理改变[11,12]。Cys C基因突变主要在基因启动子处，且基因突变及其频率分布受人种、地域等因素的影响较大[13]。国内关于Cys C基因多态性与MS的关系研究较少。有研究发现，Cys C+73位点的A/G突变导致了信号肽倒数第2位的丙氨酸被苏氨酸替换，而这种替换改变了Cys C向内质网和高尔基复合体的输运，通过中断信号肽与成熟蛋白的断裂来修饰Cys C的分泌加工途径，从而引起Cys C分泌减少或活性降低[14,15]。本研究结果显示，四组Cys C +73、-82位点等位基因频率比较差异无统计学意义。分析原因：①Cys C +73、-82位点基因多态性不是广西地区MS发病的候选基因位点；②Cys C +73、-82位点G等位基因可能与广西地区MS的发生、发展有关，但因本研究观察的样本例数较少，研究人群代表性还不够强，不足以检测出其相关性。

综上所述，广西壮族MS患者血清Cys C水平升高，血清Cys C水平可反映患者的肾功能状态； Cys C +73、-82位点基因多态性在汉族与壮族人群中比较无明显统计学差异，其是否是壮族MS发病的易感基因，还需进一步研究。

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广西壮族自治区卫生厅自筹经费科研课题(Z2013677)；南宁市科学研究与技术开发计划(ZC20133005)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.16.027

R589

B

1002-266X(2017)16-0080-03

2016-08-18)