刘金山，李迪，武首先

(内蒙古民族大学附属医院，内蒙古通辽028000)

脂联素对老化骨髓间充质干细胞自发性骨化的影响

刘金山，李迪，武首先

(内蒙古民族大学附属医院，内蒙古通辽028000)

目的 探讨老化骨髓间充质干细胞(BMSCs)的自发性骨化过程及脂联素在这一过程中的作用。方法 将第2代BMSCs(分离自一小儿畸形断肢的残指)分为空白对照组及脂联素低、中、高剂量组。空白对照组加入DMEM/F12培养基及10%胎牛血清，脂联素低、中、高剂量组分别在此基础上加入终浓度为0.5、1.0、2.0 μg/mL的脂联素，各组均传代培养至第10代。收集各组第2代和第10代细胞，茜素红S染色后计算钙化物染色率，qPCR法检测骨钙素(OCN)mRNA相对表达量。结果 与第2代细胞比较，各组第10代细胞钙化物染色率、OCN mRNA相对表达量均升高(P均<0.05)；与空白对照组第10代细胞比较，脂联素低、中、高剂量组钙化物染色率、OCN mRNA相对表达量均升高，但脂联素中、高剂量组升高更明显(P均<0.05)。结论 BMSCs在传代过程中可发生自发性骨化，脂联素可促进这一过程，并呈浓度依赖性。

骨髓间充质干细胞；脂联素；骨钙素；成骨分化；细胞传代

骨髓间充质干细胞(BMSCs)是一种具有自我更新和分化潜能的成体干细胞，可分化为多种成熟细胞。BMSCs可修复受损的骨组织，在维持骨组织代谢平衡过程中具有重要作用[1～3]。近年研究发现，BMSCs的分化能力具有在传代过程中逐渐减弱的趋势，且伴有自发性成骨的发生，其作用机制尚不明确[4]。脂联素是近年来新发现的脂肪细胞因子之一，具有增强机体对胰岛素的敏感性、抗炎、促进骨发育和抗动脉粥样硬化等生物学活性，在调节机体糖类和脂类代谢中具有重要作用[5]。研究发现，骨外伤患者体内脂肪细胞因子含量明显升高，且与患者的年龄相关[6，7]。2016年2～5月，本研究通过多次传代构建老化的BMSCs模型，观察了脂联素在诱导老化BMSCs自发性骨化过程中的作用。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 主要试剂：QuantiTect Probe RT-PCR Kit试剂盒购自德国凯杰公司，茜素红S染色试剂盒购自上海中乔新舟生物科技有限公司，0.25%EDTA胰酶购自美国Hyclone公司，TRIzol和α-MEM培养基购自美国GE公司，CD45-Percp、CD34-PE、HLA-DR-FITC、CD29-PE、CD44-FITC、CD105-APC购自美国BD公司；脂联素购自美国Sigma-Aldrich有限公司；分析纯试剂购自国药集团北京分公司；二抗购自中杉金桥生物技术有限公司。主要仪器：细胞培养箱购自美国热电公司，Allegra 64R低温高速离心机、CytoFLEX流式细胞仪购自德国Beckman公司，CX51荧光倒置显微镜购自日本奥林帕斯公司，MyCycler PCR仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2 BMSCs分离及鉴定 经患者本人及其家属同意，经我院伦理委员会批准，取我院骨外科一小儿畸形断肢的残指，于超净工作台中反复使用75%乙醇消毒。手术刀分离断肢的肌肉、肌腱，取出残肢内的指骨，用咬骨剪剪断指骨两端。注射器抽取含10%胎牛血清的α-MEM培养基20 mL，从指骨一端反复冲洗骨髓腔，并将液体收集于50 mL离心管中。PBS冲洗，1 500 r/min离心5 min，取细胞悬液用含10%胎牛血清的α-MEM培养基培养3天，半量换液。培养第7天时，显微镜下观察BMSCs生长情况，取贴壁生长的细胞进行消化并传代。取消化下来的部分BMSCs，1 500 r/min离心5 min，弃除培养基；使用PBS清洗2次后重悬，并调整细胞密度为1×106个/mL，制备单细胞悬液。取200 μL单细胞悬液，分别加入CD45-Percp、CD34-PE、HLA-DR-FITC、CD29-PE、CD44- FITC、CD105-APC不同类型的流式抗体5 μL，避光室温孵育15 min，上流式细胞仪检测CD45、CD34、HLA-DR、CD29、CD44和CD105在BMSCs中的表达。以阳性表达率>99%定义为阳性，<1%定义为阴性。结果显示，细胞表面CD45、CD34、HLA-DR表达均为阴性，CD29、CD44、CD105表达均为阳性，证实分离的细胞为BMSCs。

1.3 细胞分组处理 将BMSCs用0.1%胰酶消化后，接种到25 cm2培养瓶中，原代培养至第7 天(第2代)。将第2代BMSCs分为空白对照组及脂联素低、中、高剂量组。空白对照组加入DMEM/F12培养基及10%胎牛血清，脂联素低、中、高剂量组分别在此基础上加入终浓度为0.5、1.0、2.0 μg/mL的脂联素。将细胞按照1∶3的比例每3 天传代1次，保持脂联素在各组培养基中的浓度，融合至90%后进行传代，传至第10代。

1.4 BMSCs自发性骨化及脂联素对自发性骨化影响的观察

1.4.1 细胞钙化情况 取各组原代细胞培养至第2代和传代培养至第10代的细胞，分别行茜素红S染色。方法如下：将细胞用PBS冲洗两遍，4%多聚甲醛固定10 min；PBS继续冲洗两遍，加入茜素红S染液，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗两遍。严格按照茜素红S染色试剂盒说明书进行操作。40倍显微镜下观察钙盐沉积情况(茜素红)可将钙化物染成红色，随机选取10个视野，采用Image Pro Plus6.0软件分析钙化物面积。钙化物染色率=茜素红S染色面积/低倍镜视野总面积×100%。实验重复5次。

1.4.2 细胞骨钙素(OCN)mRNA表达 采用qPCR法。取各组原代培养至第2代和传代培养至第10代的细胞，TRIzol裂解后提取总RNA，合成cDNA后，对MIB2和内参基因GAPDH mRNA进行实时定量PCR扩增。PCR反应体系20 μL：上、下游引物1 μL，ddH2O 8.5 μL，cDNA 0.5 μL，SYBR绿色荧光染料10 μL。PCR反应条件：95 ℃、3 min，循环1次；95 ℃、12 s，62 ℃、60 s，循环35次；62～95 ℃，每2 s升高0～2 ℃，循环1次。OCN引物序列：上游引物：5′-TGCAAAGCCCAGCGACTCT -3′，下游引物：5′-AGTCCATTGTTGAGGTAGGG-3′，引物长度：20 bp；GAPDH引物序列：上游引物：5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，下游引物：5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′，引物长度：19 bp。采用2-ΔΔCt法计算OCN mRNA相对表达量。实验重复6次。

2 结果

2.1 各组细胞钙化物沉积情况比较 与第2代细胞比较，各组第10代细胞钙化物染色率均升高(P均<0.05)；与空白对照组第10代细胞比较，脂联素低、中、高剂量组钙化物染色率均升高，但脂联素中、高剂量组升高更明显(P均<0.05)。见表1。

表1 各组钙化物染色率比较

注：与同组第2代比较，*P<0.05；与空白对照组比较，#P<0.05；与脂联素低剂量组比较，△P<0.05。

2.2 各组OCN mRNA相对表达量比较 与第2代细胞比较，各组第10代细胞OCN mRNA相对表达量均升高(P均<0.05)；与空白对照组第10代细胞比较，脂联素低、中、高剂量组OCN mRNA相对表达量均升高，但脂联素中、高剂量组升高更明显(P均<0.05)。见表2。

表2 各组OCN mRNA相对表达量比较

注：与同组第2代比较，*P<0.05；与空白对照组比较，#P<0.05；与脂联素低剂量组比较，△P<0.05。

3 讨论

骨形成在人体发育过程中具有一定规律性：在青年期以前，骨可以由骺软骨逐渐骨化形成；而成年期以后，骨的来源主要依靠成骨细胞和破骨细胞在骨组织内的代谢平衡完成[8]。BMSCs作为已知成骨细胞的主要来源，在骨细胞的自我更新过程中发挥重要作用。但是随着传代数量的增加，BMSCs的分化和增殖能力逐渐改变，可以发生自发性骨化和自发性脂肪化等不同现象，其原因目前尚不明确。

脂肪细胞因子是上世纪80年代发现的由脂肪细胞分泌的补体因子，最初是由Friedman研究组在1994年首先克隆出肥胖基因的表达产物——瘦素，从而开启了脂肪细胞因子的新时代[10]。随后脂肪细胞因子家族中的其他成员逐渐被发现，包括脂联素、抵抗素、TNF-α和IL-6等，目前已经确认的脂肪细胞因子有20多种。脂联素是由体内脂肪组织和脂肪细胞分泌的脂肪细胞因子之一，其基因定位于染色体3q27，蛋白质分子量为30 kDa，由244个氨基酸组成，在人体血液中以三聚体、六聚体和多聚体的形式微量存在，其浓度为2～25 mg/L，在女性血液中的含量较男性高[11，12]。脂联素在调节机体糖类和脂类代谢中发挥重要作用，其在体内可以通过激活AMPK、PPAR-α和p38MAPK等信号通路，发挥增强机体对胰岛素的敏感性、抗炎、促进骨发育和抗动脉粥样硬化等生物学活性[13，14]。研究显示，骨外伤患者体内脂肪细胞因子含量明显增高，推测脂肪细胞因子可能与骨组织的修复有关[9]；老年人在骨折愈合的过程中体内脂联素含量明显升高[15]。说明脂联素可能在骨形成的过程中发挥一定作用。

钙化物沉积及OCN表达升高是BMSCs发生自发性骨化的特异性标志。骨骼在形成的过程中，钙化物不断沉积在骨小梁表面，是形成骨密质的主要成分。因此，钙化沉积可以反映出骨组织的形成情况。OCN是成骨细胞特异分泌的一种蛋白质，可促进骨骼的钙化过程，被认为是骨组织形成过程中的重要标志蛋白之一。本研究结果显示，各组第2代细胞钙化物染色率、OCN mRNA相对表达量比较差异均无统计学意义，这是由于在BMSCs分化的早期，细胞增殖能力较强而分化能力相对较弱，因此并未出现分化现象。本研究各组第10代细胞钙化物染色率、OCN mRNA相对表达量均明显高于第2代细胞，说明BMSCs在传代过程中分化能力增强，发生了自发性骨化。本研究第10代细胞脂联素低、中、高剂量组钙化物染色率、OCN mRNA相对表达量均高于空白对照组，但脂联素中、高剂量组升高更明显，说明脂联素可促进BMSCs在传代过程中的自发性骨化过程，并呈浓度依赖性。

本研究结果有助于揭示BMSCs自发性骨化的机制，为临床骨代谢过程的研究提供依据。通过监测骨质疏松患者血液中脂联素水平， 并分析其骨代

谢情况，在预防老年性骨质疏松等方面具有一定的参考价值。

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内蒙古自治区教育厅科技计划项目(NJZY173)。

武首先(E-mail: wushouxian@yeah.net)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.16.012

R329

A

1002-266X(2017)16-0041-03

2016-10-11)