翟倩倩, 李 健



恩诺沙星对脊尾白虾APND、ECOD和GST活性的影响

翟倩倩1, 2, 李 健1, 2

(1. 中国水产科学研究院黄海水产研究所农业部海洋渔业可持续发展重点实验室, 山东青岛 266071; 2. 青岛海洋科学与技术国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室, 山东青岛266200)

为研究脊尾白虾()药物代谢酶对恩诺沙星的响应及其在恩诺沙星代谢过程中的作用, 作者以10、20和40 mg/kg恩诺沙星连续投喂脊尾白虾3 d, 于投喂后的第1、2天以及停止投喂药物的第1、4、8、12、24、48、72、120 小时取样, 测定了脊尾白虾肝胰腺、鳃和血清中的氨基比林-N-脱甲基酶(aminopyrine-N-demethylase, APND)、7-乙氧基香豆素-O-脱乙基酶(7-ethoxycoumarin- O-Deethylase, ECOD)和谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferase, GST)的活性。结果表明: 不同浓度恩诺沙星对脊尾白虾肝胰腺、鳃和血清中Ⅰ相药物代谢酶APND和ECOD活性均呈现显著抑制作用(<0.05)。投喂药物后, APND和ECOD活性呈现先下降后逐渐上升趋势, 3个剂量组酶活性均在最后一次给药后8 h达到最低。与对照组相比, 不同浓度恩诺沙星对各组织中Ⅱ相药物代谢酶GST活性呈现显著诱导作用(<0.05), 此作用呈现先上升后下降的趋势。恩诺沙星对脊尾白虾APND、ECOD及GST活性的作用均呈现剂量依赖性。本研究表明, 脊尾白虾Ⅰ相和Ⅱ相代谢酶均会对药物做出反应, 可作为其养殖过程中药物代谢及适用性的指示物。

脊尾白虾(); 恩诺沙星; 氨基比林-N-脱甲基酶(APND); 7-乙氧基香豆素-O-脱乙基酶(ECOD); 谷胱甘肽-S-转移酶(GST)

脊尾白虾()是中国重要的经济虾类之一, 因其繁殖能力强、生长速度快、环境适应性广, 被广泛用于池塘单养、虾蟹混养和虾池秋冬季养殖, 已成为中国江苏、浙江、山东等沿海滩涂地区主要的特色水产养殖品种[1-3]。但近年来伴随着虾类养殖产业高密度生产的集约化, 脊尾白虾养殖不断受到病害频发的困扰, 药物使用仍然是目前水产养殖中病害防治的主要手段[4-5]。恩诺沙星(Enrofloxacin)为第3代喹诺酮类动物专用抗菌药物, 因其抗菌谱广、疗效显著等特点, 被广泛应用于兽医临床, 在中国经济鱼虾类病害防治过程中发挥积极作用[6-8]。但此药物在食品动物中的残留会引起部分人群产生过敏反应、恶心、腹泻、软骨损伤等损害, 甚至导致耐药性的产生[9], 因而其在可食性动物组织中的代谢和残留已经引起广泛关注。

药物在生物体内的代谢转化主要是通过药物代谢酶起作用, 细胞色素P450(cytochrome P450, CYP450)和谷胱甘肽-S-转移酶(gultathione-S-transferases, GST)是药物转化过程中的两个重要代谢酶系[10-11]。CYP450酶作为药物代谢Ⅰ相酶能对药物分子进行官能团化反应, 使药物发生氧化、还原或水解作用。GST(gultathione-S- transferases, GST)是药物代谢Ⅱ相反应中一类重要的药物代谢转移酶, 可催化谷胱甘肽(GSH)等内源性物质与Ⅰ相代谢产物结合, 使药物排出体外[12], 在解毒系统中起重要作用。以往研究表明, 海洋动物体内的CYP450和GST活性可以受到多种外源物质的影响, 包括药物、金属离子、原油、有机物等[13-15]。

药物代谢酶活性的诱导或抑制可改变药物的代谢, 并影响药效和毒性。许多药动学特征(药物半衰期、药物间相互作用、清除率、生物利用度及药物残留等)均与药物代谢酶有关[16]。研究药物对药物代谢酶的作用, 对于保证临床合理给药、避免药物不良反应以及控制药物残留都具有重要价值。但同一种外源物质对不同物种药物代谢酶的作用并不完全一致[17]。国内外学者围绕药物对水产养殖动物药物代谢酶的影响进行了多项相关研究, 涉及的药物包括氟苯尼考[18]、呋喃西林[19]、黄岑苷[20]、磺胺二甲嘧啶[21]等, 研究物种包括凡纳滨对虾()[18]、中国对虾()[19-20]、大菱鲆()[21]、鲫鱼()[22]等。但目前尚未有恩诺沙星对脊尾白虾药物代谢酶活性影响的报道。

本研究采用药饵给药的方法, 研究了不同剂量恩诺沙星对脊尾白虾Ⅰ相酶氨基比林-N-脱甲基酶(aminopyrine-N-demethylase, APND)、7-乙氧基香豆素-O-脱乙基酶(7-ethoxycoumarin-O-Deethylase, ECOD)及Ⅱ相酶谷胱甘肽-S-转移酶活性的影响, 以期探讨上述酶类对恩诺沙星的响应及其在脊尾白虾体内恩诺沙星代谢过程中的作用。这对于脊尾白虾养殖中恩诺沙星的合理使用、科学联合用药及控制药物残留都具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料与主要试剂

实验动物为健康脊尾白虾, 购于昌邑市海丰水产养殖责任有限公司, 平均体长4.07 cm±0.45 cm, 体质量1.12 g±0.21 g, 于PVC 桶(200 L)中暂养1 周, 每桶50 尾。实验期间, 水温(22±2)℃, 盐度23±1, pH 8.0±0.3, 不间断充气, 每天换水1/3, 并投喂不含药物的虾基础饵料。

恩诺沙星(含量98%)购自德邦制药公司。

1.2 实验设计

实验设1个对照组和3个实验组(高、中、低剂量组), 每组50尾虾。对照组投喂不含药物的基础饵料, 药物组投喂自制药饵。基础饵料配方如下: 鱼粉(46%)、花生粉(25%)、豆粕(10%)、面粉(7%)、鱼油(5%)、玉米粉(5%)、鱼膏(2%)。含药饵料采用鸡蛋作为黏合剂, 按照每天每千克虾体质量摄食量20 g计算, 结合药效学实验和药典推荐剂量, 将恩诺沙星药粉分别按照10 mg/kg(低剂量组)、20 mg/kg(中剂量组)和40 mg/kg(高剂量组)的给药剂量添加制得, 饲料直径约2 mm。

投饵及样品采集: 实验前一天停止投喂基础饵料, 实验开始后, 实验组分别投喂含不同剂量恩诺沙星的含药饵料, 每天早晚各投喂1次, 连续投喂3 d含药饵料后改喂基础饵料, 对照组以同样方式投喂不含药物的基础饵料。分别于给药期间的1、2 d (24、48 h)及最后一次给药后的1、4、8、12、24、48、72、120 h(1、4、8、12、24、48、72、120 hP)用一次性注射器于脊尾白虾第一腹节处抽取血淋巴, 4℃静置2h后5 000 r/min离心10 min, 取上层血清保存至–70℃冰箱直至分析, 肝胰腺和鳃组织样品取出后也于–70℃保存直至分析。

1.3 样品制备

S9微粒体制备: 肝胰腺和鳃S9微粒体的制备参照沈钧[23]等改进的方法进行, 用预冷的PBS缓冲液反复冲洗肝胰腺和鳃组织3次, 除去表面血污, 用滤纸吸干称质量, 并按1︰5()的比例加入预冷的匀浆缓冲液(0.1mol/L pH 7.5 PBS, 含1mmol/L EDTA- 2Na, 1 mmol/L PMSF, 1 mmol/L PTU, 0.1 mmol/L DTT, 15%甘油), 将肝胰腺和鳃转入Precellys 24 dual多功能样品均质器匀浆, 将匀浆液离心(4℃, 13 500 g, 25 min), 上清液用两层已被PBS缓冲液润湿过的纱布过滤, 将漂浮的脂类物质除去, 即制成S9部分, 分装于离心管中, 置于液氮中保存。制备好的S9微粒体用于测定其中代谢酶的活性。

1.4 S9蛋白含量测定

牛血清白蛋白标准曲线的制备: 在试管中分别加入0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL BSA母液(1 g/L), 补充双蒸水至1 mL, 参照Brandford方法测定蛋白含量, 以系列浓度的牛血清白蛋白为横坐标, A值为纵坐标, 得出牛血清白蛋白标准曲线回归方程。

S9蛋白浓度测定: 将待测样本稀释20倍, 取稀释后样本0.1 mL, 其余步骤参照标准曲线制作方法, 根据线性回归方程计算S9样品蛋白含量, 以便于计算单位蛋白中的酶活性。

1.5 药物代谢酶活性测定

1.5.1 氨基比林-N-脱甲基酶(APND)活性测定

APND活性的测定参照文献[24]的方法并适当修改, 取0.1 mol/L PBS(pH=7.4)缓冲液1.7 mL, 加S9蛋白悬液0.1 mL, 氨基比林(24 g/L)0.1 mL, 25℃水浴2 min后, 测定管加10 mmol/L NADPH 0.1 mL, 空白管加双蒸水0.1 mL, 25℃水浴30 min。各管加15%ZnSO40.35 mL, 混匀, 冰浴5 min, 加饱和Ba(OH)20.35 mL, 混匀, 室温放置5 min后5 000 r/min离心10 min。取上清2 mL, 加Nash试剂2 mL, 60℃水浴10 min, 自来水冷却, 紫外可见分光光度计于420 nm测定吸光值。

1.5.2 7-乙氧基香豆素-O-脱乙基酶(ECOD)活性测定

ECOD活性的测定参照文献[25]改进的方法进行。反应在96孔酶标板黑板中进行, 反应过程如下: 取0.1 mol/L PBS匀浆缓冲液(含2 mmol/L 7-乙氧基香豆素)140 µL, 加入S9悬液10 µL, 27℃孵育5 min, 测定管加10 mmol/L NADPH 10 µL, 空白管加相应体积缓冲液, 37℃水浴10 minx=380,m=460条件下测定其产物7-羟基香豆素浓度。

1.5.3 谷胱甘肽-S-转移酶(GST)活性测定

参照谷胱甘肽-S-转移酶测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书。

1.6 数据处理

2 结果

2.1 恩诺沙星对脊尾白虾Ⅰ相代谢酶活性的影响

2.1.1 氨基比林-N-脱甲基酶(APND)活性

如图1所示, 恩诺沙星对脊尾白虾肝胰腺、鳃和血清APND活性均呈现抑制作用, 且该抑制作用存在一定的时间和剂量效应。随恩诺沙星浓度的升高, 肝胰腺、鳃和血清中APND活性受到的抑制作用愈加明显, 且3组织中APND活性均呈现先降低后上升的趋势。低剂量组肝胰腺中APND活性在末次给药后的4~48 h与对照组有显著性差异(<0.05), 中剂量组在末次给药后的1~72 h与对照组有显著性差异(<0.05), 高剂量组除末次给药后的120 h外, 其余时间点肝胰腺APND活性均与对照组有显著性差异(<0.05)。其中末次给药后的8 h 3个剂量组的肝胰腺APND活性最低, 高、中、低剂量组APND的活性分别为对照组的11.87%、14.73%、17.87%。给予恩诺沙星药饵后, 3个剂量组的脊尾白虾鳃和血清中的APND活性均在末次给药后的8 h时达到最低, 其中鳃组织中高、中、低剂量组的APND活性分别为2.71、3.48、4.02 nmol/(min·mg), 为对照组的26.57%、34.12%、39.41%。血清中高、中、低剂量组APND活性分别为0.87、1.16、1.62 nmol/(min·mg), 为对照组的13.81%、18.41%、25.72%。

标有不同字母者表示在同一时间点组间差异显著(<0.05), h指给药期间的取样点, hP为最后一次给药结束后的取样点。图2、图3同

The different letters indicate significant differences between the groups at the same time point (<0.05); h refers to the sampling point during administration, hP is the sampling point after the end of the administration. the same as Fig.2, Fig.3

2.1.2 7-乙氧基香豆素-O-脱乙基酶(ECOD)活性

由图2可知, 各剂量组恩诺沙星对脊尾白虾肝胰腺、鳃和血清ECOD活性均呈现抑制作用。3个组织中ECOD活性均在末次给药后的8 h达到最低, 随后逐渐恢复至对照组水平。末次给药8 h后, 肝胰腺中高、中、低剂量组的ECOD活性分别为对照组的44.47%、55.26%、60.53%, 鳃组织中为56.16%、60.27%、63.01%, 血清中为55.56%、66.67%、77.78%。不同的是, 血清中ECOD的抑制效应较肝胰腺和鳃组织出现和消失得更快, 血清中ECOD活性在给药第2天即出现抑制作用, 而肝胰腺和鳃组织在末次给药后的1 h才出现抑制作用; 3个剂量组的血清ECOD活性在末次给药后的72 h均恢复至对照组水平, 而3个剂量组的肝胰腺和鳃组织ECOD活性在末次给药后的120 h才均恢复至对照组水平。恩诺沙星对脊尾白虾肝胰腺、鳃和血清ECOD活性的抑制存在剂量依赖性, 抑制率整体呈现为高剂量组>中剂量组>低剂量组。

2.2 恩诺沙星对脊尾白虾Ⅱ相酶谷胱甘肽- S-转移酶(GST)活性的影响

如图3所示, 脊尾白虾连续投喂恩诺沙星饵料后, 肝胰腺、鳃和血清中GST均被诱导, 活性呈先上升后降低的趋势。肝胰腺中GST活性在8 hP达到最高, 低、中、高3个剂量组GST活性分别是187.23、240.78、278.41 U/mg 蛋白, 为对照组的2.64、3.06和3.59倍, 低剂量组在末次给药后48 h恢复至对照组水平, 中、高剂量组在末次给药后72 h恢复至对照组水平(>0.05); 鳃中GST活性也在8 hP达到最高, 低、中、高3个剂量组GST活性分别是99.12、135.26、152.64 U/mg, 为对照组的1.71、2.33和2.62倍, 低、中剂量组在48 hP恢复至对照组水平, 高剂量组在72 hP恢复至对照组水平(>0.05); 与肝胰腺和鳃不同, 恩诺沙星对血清中GST的诱导效应较肝胰腺和鳃中出现和消失都更早, 3剂量组的GST活性均在4 hP达到最高, 低、中、高剂量组分别对照组的1.55、1.89、2.39倍, 低、中剂量组GST活性在12 hP恢复至对照组水平, 高剂量组在24 hP恢复至对照组水平(>0.05)。

3 讨论

APND和ECOD分别是CYP450家族中CYP2B和CYP1A活性的标志酶, 是生物体内参与外源污染物Ⅰ相反应代谢过程中重要的两个解毒酶。CYP2B主要代谢各种亲脂性药物和固醇类药物[22, 26], 使其转化为易于排泄的代谢产物, 从而起到解毒作用; CYP1A是一种芳香基碳氢化合物氢化酶, 目前已成为评价环境污染状况的最灵敏的生物标志物之一, 广泛应用于毒理学研究[27]。本实验中, 不同浓度的恩诺沙星连续作用于脊尾白虾后, 随着作用时间的延长, 其肝胰腺中APND和ECOD活性均逐渐被抑制, 呈现先下降后上升的趋势, 且该抑制作用存在一定的时间和剂量效应, 这与文献报道喹诺酮类多种药物对CYP450代谢酶的主要表现为抑制作用一致。张喆等[28]的研究显示, 诺氟沙星对中国明对虾()鳃和血清的APND具有抑制作用, 酶活性先下降后上升。Vaccaro等[29]研究表明恩诺沙星对舌齿鲈()红霉素-N-脱甲基酶(ERND)活性具有抑制作用。韩华等[30]探讨了喹诺酮类药物对牙鲆肝脏CYP450酶活性的影响, 结果表明诺氟沙星对APND和ERND酶活性均具有显著性抑制作用(<0.01)。关于恩诺沙星等喹诺酮类药物对CYP450的抑制机制, Fuhr等学者[31]认为与喹诺酮类药物的分子组成及空间构象有关, 喹诺酮类药物分子中8位上没有取代基或7位哌嗪基3’和4’上无甲基等取代基, 使其对CYP450酶具有较强的抑制作用。CYP450酶活性的抑制作用可通过多种途径实现, 如抑制蛋白的合成、降低细胞色素P450含量、影响药物氧化过程中电子传递及辅酶的合成等[32]。除肝胰腺外, 恩诺沙星对脊尾白虾鳃中的APND、ECOD酶活性也具有较强的抑制作用, 说明脊尾白虾鳃丝也存在丰富的CYP450酶, 在代谢外源物质的过程中也起着重要的作用。虽然甲壳动物的肝胰腺被公认为是CYP450依赖的转化外源物质的主要器官, 但是其他组织包括鳃、胃、肠和触角腺均被证明具有CYP450活力, 在部分外源物质及生理上重要的内源物质的代谢过程中也具有举足轻重的地位[33]。此外, 恩诺沙星对血清APND、ECOD活性抑制作用的出现和消失均早于肝胰腺和鳃组织, 可能与甲壳类的开放式循环系统有关。

GST是药物代谢Ⅱ相反应中一类重要的药物代谢转移酶, 可催化许多内外源性物质的亲电基团与还原型谷胱甘肽的巯基结合, 增加其疏水性使其易于穿越细胞膜排出体外, 具有消除体内自由基和解毒的双重功能[34]。文献报道显示许多外源物质可对GST活性产生诱导作用。聂湘平等[35-36]研究发现环丙沙星可以分别显著诱导异育银鲫()和剑尾鱼()GST活性。吴伟等[37]以不同浓度的溴氰菊酯处理罗非鱼()25 d, 发现体内GST的活性先被显著诱导升高, 后又降低。这可能是由于随着暴露时间的延长, 鱼体内积累了较多的氧化产物如丙二醛的含量增加, 导致体内GST酶活性受到抑制, 甚至蛋白质受到较大程度的损伤。本研究中, 恩诺沙星对脊尾白虾GST活性的影响与上述物质相一致。恩诺沙星对脊尾白虾GST活性具有诱导作用, 在恩诺沙星作用下, 脊尾白虾体内GST活性呈现先上升后下降的趋势。连续投喂恩诺沙星饵料后, 脊尾白虾血清、肝胰腺和鳃组织中GST活性分别在4和8 hP达到最大值, 在48和72 hP时, 血清、肝胰腺和鳃中GST活性又降低到与对照组相当。这是由于最初暴露时, GST活性增加, 以降低暴露物对机体产生的危害。随着暴露时间的延长, 虾体内暴露物超出了GST的承载力, 丙二醛含量逐渐升高, 肝胰腺逐渐受到损伤所致。丙二醛是细胞氧化代谢产物, 其含量高低反应了机体细胞受到自由基攻击的程度[38]。本实验肝胰腺对照组的GST活性远大于鳃丝, 药物组诱导程度较高, 说明脊尾白虾GST解毒途径主要经肝胰腺进行, 反映了肝胰腺在药物解毒过程中的重要地位, 而鳃为虾类的呼吸器官, 通过体内代谢吸收及体外直接接触, 鳃中GST对药物进行解毒诱导其活性升高。

本研究结果表明, 机体对恩诺沙星的代谢, 一方面通过抑制Ⅰ相代谢酶的活性, 抑制药物的活化, 另一方面通过诱导Ⅱ相代谢酶的活性, 加速药物的解毒与代谢。在实际生产中, 当恩诺沙星与其他药物合并用药时, 要注意药物合理配伍, 避免药效学的改变或药物蓄积出现不良反应。因此, 可将Ⅰ相和Ⅱ相酶活性变化作为脊尾白虾养殖过程所用药物代谢及适用性的指示物。

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Effects of enrofloxacin on APND, ECOD and GST activities in

ZHAI Qian-qian1, 2, LI Jian1, 2

(1. Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China; 2. Function Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266200, China)

To study the response of drug metabolism enzymes to enrofloxacin and their function in the metabolism of enrofloxacin, shrimp () were fed with medicated feed at doses of 10, 20, and 40 mg/(kg·BW) daily, and shrimp in each group were sampled on day 1 and day 2 during the drug exposure period and 1, 4, 8, 12, 24, 48, 72, and 120 h after the end of the drug exposure period. Levels of aminopyrine-N-demethylase (APND), 7-ethoxycoumarin-O-deethylase (ECOD), and glutathione-S-transferase (GST) were determined in the hepatopancreas, gills, and serum. Results showed that different concentrations of enrofloxacin could significantly inhibit the activities of phase I metabolism enzymes APND and ECOD in the hepatopancreas, gills, and serum (<0.05). After feeding with the drug, the activities of APND and ECOD first decreased and then increased gradually. Activities of the metabolism enzymes in the three concentration groups were lowest at 8 h after dosing. Compared with the control group, different concentrations of enrofloxacin significantly induced the activities of phase II metabolism enzyme GST in the three tissues (<0.05), and the induction of the activities were first increased and then decreased gradually. The effects of enrofloxacin on the activities of APND, ECOD, and GST were all dose dependent. In conclusion, this study demonstrated that phase Ⅰ and phase Ⅱ enzymes ofare sensitive parameters that could be used as biomarkers for evaluating the exposure to aquatic drugs.

; enrofloxacin; aminopyrine-N-demethylase (APND); 7-ethoxycoumarin-O-deethylase (ECOD); glutathione-S-transferase (GST)

S948; S913

A

1000-3096(2017)02-0053-08

10.11759//hykx20160113004

2016-01-13;

2016-07-20

山东省自然科学基金项目(BS2015HZ015); 国家虾现代产业技术体系项目(CARS-47); 山东泰山产业领军人才工程项目(LJNY2015002); 青岛海洋科学与技术国家实验室鳌山科技创新计划项目(2015ASKJ02)

翟倩倩(1984-), 女, 山东泰安人, 助理研究员, 博士, 主要从事水产药理学及水产品质量安全研究, 电话: 0532-85826690, E-mail: zqq0817@163.com; 李健, 通信作者, 研究员, 电话: 0532- 85830183, E-mail: lijian@ysfri.ac.cn

Jan. 13, 2016

[Natural Science Foundation of Shandong Province, No.BS2015HZ015; Modern Agro-industry Technology Research System, No.CARS-47; the Program of Shandong Leading Talent No.LJNY2015002; Ao Shan Scientific and Technological Innovation Project Financially Supported by Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, No.2015ASKJ02]

(本文编辑: 谭雪静)