2型猪链球菌FtsZ重组蛋白的制备及其酶活性测定

2017-04-19范伟伟孙卫平李超龙吴倩倩王长军潘秀珍

中国人兽共患病学报 2017年3期

范伟伟，倪华，孙卫平，张剑，李超龙，吴倩倩，王长军，潘秀珍

范伟伟1,2，倪华2，孙卫平2，张剑2，李超龙2，吴倩倩2，王长军2，潘秀珍1,2

目的制备2型猪链球菌丝状温度敏感蛋白(Filamentous temperature-sensitive protein Z，FtsZ)重组蛋白并测定其水解三磷酸鸟苷(GTP)的酶活性。方法从2型猪链球菌中国强毒株05ZYH33基因组中PCR扩增目的基因ftsz，构建重组表达质粒 pET28a-ftsz，转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性转化子进行 IPTG诱导表达，SDS-PAGE 鉴定表达产物，Ni2+亲和层析柱纯化重组蛋白，Western blot分析。重组蛋白免疫新西兰兔后收集多抗血清，间接 ELISA 法检测抗体效价，用孔雀绿-磷酸检测法测定FtsZ重组蛋白的GTP酶活性。结果成功构建pET28a-ftsz重组表达质粒；纯化获得大量纯度较高的FtsZ重组蛋白； ELISA检测兔多抗血清效价达1∶13 107 200；Western blot显示FtsZ重组蛋白能够与His-Tag单抗和兔多抗血清发生反应；以GTP为底物检测重组蛋白具有GTP酶活性。结论成功制备了具有GTP酶活性的2型猪链球菌FtsZ重组蛋白并以重组蛋白为抗原制备出高效价的多抗血清，为进一步研究2型猪链球菌FtsZ在细胞分裂调控过程中的作用奠定基础。

2型猪链球菌；丝状温度敏感蛋白；纯化

猪链球菌(Streptococcussuis，S.suis)为革兰氏阳性兼性厌氧菌，是重要人兽共患病病原菌，在猪链球菌33个血清型中以2型猪链球菌(S.suis2)分布最广、致病性最强、临床检出率最高[1-3]，其感染人导致脑膜炎、败血症、心内膜炎以及链球菌中毒性休克综合征(Streptococcal toxic shock syndrome，STSS)[4]。本课题组前期已完成2型猪链球菌强毒株05ZYH33全基因组的测序和注释[5]。通过基因组注释分析发现 05SSU_0481 编码丝状温度敏感蛋白 (Filamentous temperature-sensitive protein Z，FtsZ)。FtsZ 是一种细菌分裂相关蛋白，在细菌分裂过程中起重要的核心作用。目前，FtsZ在细菌分裂过程中的功能作用，在E.coli、B.subtilis、分枝杆菌等细菌中已有相关研究报道[6-7]。然而在猪链球菌中尚未见有关FtsZ的研究报道。本文以S.suis2强毒株05ZYH33为对象，对其ftsz基因进行克隆及表达，纯化获得到纯度较高并具有GTP酶活性的重组蛋白，为进一步研究 FtsZ在S.suis2细菌分裂过程中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、质粒和引物S.suis2菌株 05ZYH33 分离自2005年四川资阳的中毒性休克综合征病人的外周血，本实验室保存。

表1 菌株、质粒和引物

Tab.1 Bacterial strains, plasmid and primers used in this study

BacterialstrainsandprimersPhenotypesandcorrelativecharacteristicsSourcesBacterialstrains05ZYH33VirulentstrainisolatedfromadeadpatientwithSTSSLabcolletionE.coliDH5αCloninghostforrecombinantplasmidTransgenBL21(DE3)ExpressionhostforrecombinantplasmidTransgenPlasmidpMD18-TE.colicloningvector,lacZ,AmprTaKaRapET28aExpressionvector,kanrTaKaRaPrimers0481F5'-GGATCCATGGCATTTTCATTTG-3'(BamHI)0481R5'-CTCGAGGCGATTACGGAAGAAT-3'(XhoI)

1.1.2 试剂 PCR扩增试剂盒、质粒提取试剂盒、限制性内切酶BamHI和XhoI、T4连接酶和250 bp DNA Ladder Marker购于大连宝生物工程公司； DNA 胶回收试剂盒购自Promega公司；Malachite Green Phosphate Assay 购于sciencell；PageRuler Prestained Protein Ladder、ECL化学发光试剂盒购于Thermo scientific；HRP标记的羊抗鼠IgG、HRP标记的羊抗兔IgG购于博奥森生物工程有限公司；His-Tag单克隆抗体购自CST；Todd-Hewitt Broth (THB)，购自 Difco 公司；SDS、丙烯酰胺、N,N-2 亚甲双丙烯酰胺、卡那霉素、氨苄霉素和IPTG购于上海生工生物公司；BSA(Albumin Bovine V)购于Roche公司；其他化学试剂均为分析纯。

1.1.3 实验动物健康新西兰雌性兔(2 kg)购于南京金陵种兔场。

1.2 实验方法

1.2.1ftsz基因的筛选及生物信息学分析利用Blast软件等生物信息学工具分析本实验室S.suis2 05ZYH33全基因组中ftsz基因序列，根据其对应的氨基酸序列搜索同源蛋白，进行同源性分析，根据比对结果利用MEGA.7软件绘制FtsZ蛋白分子进化树。

1.2.2 PCR扩增目的基因以05ZYH33全基因组为模板，用引物F 5′-GGATCCATGGCATTTTCATTTG-3′(BamHI)，R5′-CTCGAGGCGATTACGGAAGAAT-3′(XhoI)进行PCR 扩增。PCR 扩增体系(25 μL)：ddH2O18.3 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP mix 2 μL，上游引物(10 μmol/L) 0.5 μL，下游引物(10 μmol/L) 0.5 μL， Ex Taq 酶(5 U/μL) 0.2 μL，模板(约 100 mg/L)1 μL。PCR 扩增条件： 95 ℃ 5 min； 95 ℃ 5 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30 个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。PCR 扩增片段经1%琼脂糖凝胶电泳分析，DNA胶回收试剂盒回收目的片段。

1.2.3 重组表达载体的构建和鉴定将ftsz目的片段与 pMD18-T克隆载体16 ℃水浴过夜连接，连接产物转化宿主菌E.coliDH5α，菌液PCR验证为阳性的转化子进行质粒提取，BamHI和XhoI双酶切鉴定及测序证实为重组质粒pMD18-T-ftsz。质粒pMD18-T-ftsz和 pET28a载体分别双酶切，回收目的片段，通过T4 DNA连接酶连接后转化至宿主菌E.coliDH5α，菌液PCR验证为阳性的转化子提取质粒，经酶切及测序验证后，重组质粒pET28a-ftsz-80 ℃保存。

1.2.4 FtsZ重组蛋白的诱导表达及纯化将重组pET28a-ftsz质粒转化E.coliBL21(DE3)，LB平板(含卡那霉素100 μg/mL)筛选阳性转化子，挑取单菌落接种于LB(含卡那霉素100 μg/mL)培养液中， 37 ℃培养12 h后，以1∶50接种于新鲜LB(含卡那霉素100 μg/mL)培养液中，37 ℃、220 r/min振荡培养至OD600为0.6左右，加入IPTG至终浓度为0.1 mmol/L，37 ℃诱导4 h，4 ℃ 以12 000 r/min 离心10 min，收集沉淀物。加适量pH 7.4的PBS(140 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4，1.8 mmol/L KH2PO4)重悬，取适量重悬的菌体加入SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液，沸水中 5 min，10% SDS-PAGE 检测目的蛋白的表达。超声破碎后离心，取上清与沉淀进行10% SDS-PAGE。对上清用Ni2+亲和层析柱进行亲和层析，用咪唑缓冲液梯度洗脱，纯化重组蛋白，10% SDS-PAGE 电泳鉴定目的蛋白的分子量和纯度。

1.2.5 FtsZ兔多抗血清的制备取400 μg FtsZ重组蛋白溶于0.01 mol/L PBS(无菌)中与等体积完全弗氏佐剂进行乳化，将乳化的FtsZ蛋白背部皮下多点注射新西兰兔；第15 d及第29 d，各取等量FtsZ重组蛋白与等体积不完全弗氏佐剂乳化，背部皮下多点注射新西兰兔；第43 d，用未经乳化的400 μg FtsZ重组蛋白对新西兰兔加强免疫。加强免疫后第7 d耳缘静脉采血测定其抗体效价，然后采血并分离血清。

1.2.6 间接 ELISA 测定血清抗体效价纯化的FtsZ重组蛋白以5 μg/mL 100 μL/孔4 ℃过夜包被ELISA 96孔板，PBST洗3次，3% BSA 37 ℃封闭2 h，PBST洗3次，分别加入100 μL/孔梯度稀释的FtsZ兔多抗血清，阴性对照采用免疫前兔血清，37 ℃孵育1 h，PBST洗3次，加入100 μL/孔1∶5 000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG，于37 ℃孵育1 h，PBST洗3次，加入100 μL/孔TMB显色避光5～10 min，然后加入100 μL/孔2 mol/L H2SO4终止反应，酶标仪于450 nm处读取OD值，计算P/N值大于2.1时即为阳性结果。

1.2.7 Western blot分析取FtsZ重组蛋白，加入SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液，沸水煮 5 min，进行10%SDS-PAGE电泳，采用电转印(湿转恒流 300 mA 70 min)将蛋白转移至PVDF膜上，然后用封闭液(含5% 脱脂牛奶的TBST)室温封闭2 h，TBST洗膜，将膜分别与1∶1 000稀释的His-Tag单抗和1∶4 000稀释FtsZ兔多抗血清孵育4 ℃过夜，TBST洗膜，再将膜分别与HRP标记的羊抗鼠IgG和羊抗兔IgG37 ℃孵育2 h，TBST洗膜，ECL化学发光显色。

1.2.8 FtsZ重组蛋白GTP酶活性的测定参照文献[8]利用孔雀绿磷酸盐分析法测定FtsZ重组蛋白GTP酶活性。FtsZ重组蛋白(0.59 mg/mL)分别置于用缓冲液(50 mmol/L Tris pH 7.5，5 mmol/L MgCl2，250 mmol/L KCl)配制的不同浓度的GTP(0 mmol/L、0.04 mmol/L、0.08 mmol/L、0.16 mmol/L、0.31 mmol/L、0.62 mmol/L、1.25 mmol/L 、2.5 mmol/L)中37 ℃孵育25 min，加入终止液(65 mmol/L EDTA，50 mmol/L Tris pH 7.5，5 mmol/L MgCl2，250 mmol/L KCl)终止反应。加入Malachite Green Reagent A 室温反应10 min，Malachite Green Reagent B 室温反应20 min，用酶标仪检测630 nm处的吸光度值。同时绘制磷酸标准曲线。酶活性单位定义为：以每分钟每毫克的酶蛋白作用于底物GTP所释放Pi的纳摩尔数(nmolPi/mg/min)来表示。

2 结果

2.1 05ZYH33中ftsz基因的生物信息学分析通过Blast比对发现，05ZYH33基因组中SSU05_0481蛋白属于微管蛋白超家族，与其他链球菌中丝状敏感蛋白同源性为78%～88%，说明其在进化过程中高度保守。根据比对结果利用MEGA.7软件绘制FtsZ蛋白的分子发育树(图1)。

图1 FtsZ蛋白的分子进化树Fig.1 Phylogenetic trees of FtsZ protein

2.2 目的基因的扩增以S.suis2 05ZYH33 基因组DNA为模板，对目的基因ftsz进行 PCR 扩增，PCR 产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测(图 2)。结果显示，在 1 200 bp有一特异性条带，片段大小与ftsz(1 227 bp)基本相符。

M：DNA marker；1：PCR产物M: DNA marker; 1: products of PCR 图2 PCR扩增结果Fig.2 Agarose gel electrophoresis of the PCR products of target gene

2.3 重组表达载体的构建与鉴定将重组表达载体pET28a-ftsz经BamHI和XhoI双酶切后进行1%琼脂糖凝胶电泳，获得1 200 bp左右的目的片段(图3)，测序结果显示该片段全长1 227 bp，与ftsz基因序列完全相同，说明pET28a-ftsz质粒构建正确。

M：DNA marker；1：重组质粒；2：XhoI单酶切；3：BamHI+XhoI双酶切M:DNA marker; 1: pET28a-ftsz; 2: pET28a-ftsz/XhoI; 3: pET28a-ftsz/BamHI+XhoI图3 重组质粒pET28a-ftsz酶切鉴定Fig.3 Identification of the recombinant plasmid pET28a-ftsz by restriction enzymes

2.4 重组蛋白的表达重组表达质粒pET28a-ftsz转化E.coliBL21(DE3)，经0.1 mmol/L IPTG诱导，SDS-PAGE分析蛋白诱导表达情况。结果显示IPTG诱导的表达菌，在约50 kD处有一明显的新生蛋白条带(图4)。

M：蛋白Marker；1：未诱导的pET28a /BL21； 2：IPTG诱导的pET28a/BL21；3：未诱导的pET28a-ftsz/BL21；4：IPTG诱导的pET28a-ftsz/BL21M: protein Marker; 1: pET28a/BL21 uninduced with IPTG; 2: pET28a/BL21 induced with IPTG; 3: pET28a-ftsz/BL21 uninduced with IPTG; 4: pET28a-ftsz/BL21 induced with IPTG图4 重组质粒转化菌表达产物SDS-PAGE检测Fig.4 SDS-PAGE analysis of recombinant expression product

2.5 FtsZ重组蛋白可溶性表达鉴定及纯化经IPTG诱导的表达菌，超声破碎后其上清中含有大量目的蛋白，表明目的蛋白能够在上清中可溶性表达。利用Ni2+亲和层析柱对上清进行纯化，纯化后获得纯度较高的FtsZ重组蛋白。

M：蛋白 Marker；1：重组质粒转化菌IPTG诱导超声后上清；2：重组质粒转化菌IPTG诱导超声后沉淀；3：纯化的FtsZ蛋白M: protein Marker; 1: The supernatant lysed by sonication; 2: Insoluble pellets lysed by sonication; 3: Purified FtsZ protein图5 FtsZ重组蛋白SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of recombinant FtsZ protein

2.6 FtsZ兔多抗血清制备及抗体效价检测用纯化的FtsZ重组蛋白免疫新西兰兔后，收集兔多抗血清，采用间接ELISA 方法测定其抗体效价为1∶13 107 200(图6)。

图6 间接ELISA法检测血清抗体效价Fig.6 Serum antibody titer detect by indirect ELISA

2.7 Western blot 分析 Western blot结果显示FtsZ重组蛋白不但可以与His-Tag单抗发生反应(图7A)，而且还可以与其兔多抗血清发生反应(图7B)。

A：FtsZ与His-tag单抗免疫印迹； B：FtsZ与兔多抗血清免疫印迹A: Western blot with monoclonal antibody against His-tag; B: Western blot with rabbit serum against recombinant FtsZ图7 FtsZ的免疫印迹Fig.7 Western blot analysis of the recombinant FtsZ

2.8 FtsZ重组蛋白的GTP酶活性测定 FtsZ重组蛋白的GTP酶活性由Pi释放量表示。FtsZ重组蛋白(0.56 mg/mL)与不同浓度的GTP(0～2.5 mmol/L)反应，测定630 nm的吸收值，通过Pi标准液绘制标准曲线y=0.009 9x+0.0215(R2=0.991 8)进行换算，得出不同GTP浓度下，Pi的释放量，从而反映FtsZ的GTP酶活性。结果显示随着底物GTP浓度的增加，Pi释放量增加，说明纯化得到具有GTP酶活性的FtsZ重组蛋白(图8)。

图8 FtsZ的GTP酶活性测定Fig.8 GTPase activity of FtsZ

3 讨论

FtsZ是一种存在于除支原体、衣原体和古细菌外几乎所有原核生物中重要的、高度保守的细菌分裂相关蛋白，在细菌分裂过程中起着十分重要的作用[9-10]。FtsZ是真核细胞微管同源蛋白，含有GTP 结合基序(GGGTGTG)，具有GTP酶活性[11]，细菌分裂的后期阶段即胞质分裂的过程中在GTP 的参与下在细胞中部聚合成Z 环，Z环收缩最后使一个细菌分裂成两个，完成整个细菌的分裂过程[12]。由于FtsZ在细菌分裂过程中的重要作用以及生长过程中的高度保守，被认为是抗菌药物研究的理想靶点[13]。

多项研究表明FtsZ是细菌真核样丝苏氨酸激酶(Ser/Thr kinase, STK)的磷酸化底物。Thakur等[14]对分枝杆菌的研究发现，其真核样丝苏氨酸磷酸酶(PknA)能够磷酸化FtsZ。Silvestroni等[15]运用磷酸肽富集与质谱分析发现GBS中FtsZ是真核样丝苏氨酸激酶磷酸化底物。Giefing等[16]通过免疫荧光发现肺炎链球菌StkP和FtsZ均定位于细菌分裂位点，并制备了FtsZ重组蛋白及相应的多抗血清，研究发现FtsZ可被StkP磷酸化。课题组前期对2型猪链球菌中stk基因功能研究发现，该基因的缺失会导致分裂表型异常，透射电子显微镜显示stk基因敲除株中细胞隔膜形成受阻[17]，其具体机制不明。基因组注释05SSU_0481 编码蛋白为细胞分裂蛋白FtsZ[5]，为探究S.suis2中FtsZ在细胞分裂过程中的功能作用以及与STK的相互关系，本研究从S.suis2中国强毒株05ZYH33基因组中克隆ftsz基因，成功构建pET28a-ftsz重组表达质粒，以低浓度IPTG诱导重组表达菌，获得大量可溶性表达蛋白，Ni2+亲和层析获得较高纯度的FtsZ重组蛋白，孔雀绿磷酸盐法活性分析表明FtsZ重组蛋白具有GTP酶活性，利用重组蛋白免疫新西兰兔获得高效价的FtsZ兔多抗血清，为进一步开展2型猪链球菌FtsZ蛋白在细胞分裂调控及抗菌药物筛选研究奠定了基础。

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Purification and enzyme activity assay of filamentous temperature-sensitive protein Z inStreptococcussuisserotype 2

FAN Wei-wei1,2, NI Hua2, SUN Wei-ping2, ZHANG Jian2, LI Chao-long2, WU Qian-qian2, WANG Chang-jun2, PAN Xiu-zhen1,2

(1.ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing211198,China;2.InstituteofMilitaryMedicalSciences,NanjingCommand,Nanjing210002,China)

We conducted purification of filamentous temperature-sensitive protein Z ofStreptococcussuisserotype 2 (S.suis2) and measured its GTPase activity. Theftszgene in the genome of the Chinese 05ZYH33 strain ofS.suis2 was successfully amplified using PCR, and then theftszgene was cloned into prokaryotic expression plasmid pET28a, and the recombinant plasmid pET28a-ftszwas transformed intoE.coliBL21. After induction by IPTG, the isolated FtsZ protein was analyzed with SDS-PAGE. Then the recombinant protein was purified by Ni2+-NTA affinity chromatography. The rabbit serum was harvested after immunization with recombinant FtsZ protein, and was analyzed by indirect ELISA and Western blotting. The GTPase activity of FtsZ was measured with the malachite green method. Results showed that successfully constructed recombinant plasmid pET28a-ftszand the recombinant protein with high purity was obtained; Western blot result indicated that FtsZ could react with the His-tag antibody and the rabbit serum; the polyclonal antibody titer of the rabbit serum reached 1∶13 107 200; FtsZ have GTPase activity. We successfully preparedS.suis2 recombinant protein FtsZ having GTPase activity and high titer antiserum would be useful for the further study ofS.suis2 cell division mechanism.

Streptococcussuisserotype 2; filamentous temperature-sensitive protein Z; purification Funded by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 81571965 & 81471920)， the Natural Science Foundation of Jiangsu Province (No.BK20151091)，and the 333 Engineering Science Foundation of Jiangsu Province (No.BRA2014363) Corresponding author: Pan Xiu-zhen,Email: panxiuzhen_2004@163.com